Hepato-metabolic phenotype in wild-type offspring to heterozygous eNOS deficient mice in regard to the concept of Fetal Programming

Hintergrund: Im Sinne der Advanced Fetal Programming Hypothese stellen maternale Gene Determinanten fetalen Wachstums und damit des späteren Krankheitsrisikos dar. NO ist ein wichtiger Mediator für die Entwicklung und Regulation des utero-plazentaren Gefäßbettes und beeinflusst intrauterines Wachstum. eNOS ist an der Bereitstellung von NO in der Plazenta maßgeblich beteiligt. Intrauterine Wachstumseinschränkung ist mit der Entwicklung einer Insulinresistenz assoziiert. Ein maternaler heterozygoter eNOS Knock-out könnte somit durch Auswirkungen auf die plazentare NO Verfügbarkeit dauerhafte Störungen des Glukosestoffwechsels programmieren. Zudem liegen Hinweise auf Programmierungseffekte über die paternale Linie vor, so dass auch solche für den heterozygoten eNOS Knock-out überprüft werden sollen. Methoden: Im Mausmodell wurden 134 ausschließlich genetisch gesunde Nachkommen heterozygoter eNOS knock-out Elterntiere über 25 Wochen gehalten. Es wurde untersucht, wie sich diese von genetisch gesunden Nachkommen einer reinen Wildtypverpaarung unterscheiden. Mögliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen genetisch gesunder Nachkommen können in diesem Design nicht durch klassische Vererbungsmechanismen erklärt werden. Von Geburt bis zur 20. Lebenswoche wurde das Körpergewicht der Tiere erfasst. Blutentnahmen für Nüchternglukosemessungen wurden in Woche 13, 17 und 21 vorgenommen. In Woche 24 wurde ein intraperitonealer Glukosetoleranztest (ipGTT) durchgeführt. Insulinkonzentrationen wurden aus Nüchternplasmen der Woche 17 und 21, sowie aus Plasmen des ipGTT, bestimmt. Nach Tötung der Tiere in Woche 25 wurden die Lebern entnommen und deren Gewicht erfasst. Histologisch wurde durch H.E. Färbung der mittlere Läppchendurchmesser und durch Oil Red O Färbung der Lipidgehalt der Lebern ermittelt. Mittels Amyloglukosidasemethode wurde der hepatische Glykogengehalt bestimmt. Die Expression wichtiger Kandidatengene für die Regulation des hepatischen Glukose- und Fettstoffwechsels sowie der hepatischen Insulinresistenz wurden mittels rtPCR gemessen. Zur Erfassung der Nierenfunktion wurden in Woche 12, 18 und 23 Stoffwechselversuche durchgeführt und in Woche 10, 19 und 24 der systolische Blutdruck mittels tail cuff Methode gemessen. Ergebnisse: Tiere mit eNOS +/- Müttern wurden signifikant leichter geboren, wobei dies auch auf männliche Tiere zutraf. Postnatal verlor sich der Gewichtsunterschied und Tiere dieser Gruppe waren vom 13. - 32. Lebenstag, weibliche Tiere auch darüber hinaus, signifikant schwerer als Kontrolltiere. Eine hepatische Lipidakkumulation war das wesentliche phänotypische Merkmal, insbesondere bei weiblichen Tieren. Letztere hatten auch ein signifikant höheres absolutes Lebergewicht. In Woche 21 hatten diese Tiere signifikant niedrigere Nüchternglukosekonzentrationen und einen starken Trend zu niedrigeren Nüchterninsulinkonzentrationen (p=0,054 vs. Mutter WT/Vater WT). Im ipGTT in Versuchswoche 24 fielen signifikant höhere Glukosekonzentrationen nach 15 Minuten, wie auch eine signifikant höhere AUC für Glukose, auf. Die Geburtsgewichte von Tieren mit eNOS +/- Vätern unterschieden sich nicht signifikant von Kontrolltieren, allerdings waren sie vom 11.–34. Lebenstag, weibliche Tiere auch darüber hinaus, signifikant schwerer. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wiesen diese Tiere in Woche 21 signifikant höhere Nüchternglukosekonzentrationen auf. Männliche Tiere dieser Gruppe hatten zudem in Woche 17 signifikant höhere Nüchterninsulinkonzentrationen. Während des ipGTT hatten Tiere mit eNOS +/- Vätern die höchsten Insulinkonzentrationen. Die AUC für Insulin zeigte sich von 0-15 Minuten signifikant gegenüber der Kontrollgruppe erhöht, und einen entsprechend starken Trend für den gesamten ipGTT (p=0,054 vs. Mutter WT/Vater WT). Ähnliche Veränderungen für Insulin hatten nur männliche Tiere. Weiterhin zeigten diese Tiere signifikant höhere hepatische Glykogen- und Lipideinlagerungen, wobei geschlechtsspezifisch erstere bei männlichen, letztere bei weiblichen Tiere ausgeprägt waren. Die durchgeführten Expressionsanalysen lieferten Hinweise auf einige differentiell exprimierte Gene. Hinsichtlich weiterer phänotypischer Merkmale zeigten sich keine relevanten Gruppenunterschiede. Schlussfolgerungen: Es konnte gezeigt werden, dass der maternale heterozygote eNOS Knockout im Sinne der Advanced Fetal Programming Hypothese in der nachfolgenden Generation zur Ausprägung eines niedrigeren Geburtsgewichtes sowie eines spezifischen hepato- metabolischen Phänotyps führt. Die der Advanced Fetal Programming Hypothese zugrunde liegenden Annahmen konnten somit für den maternale heterozygoten eNOS Knock-out bestätigt werden. Auch der paternale heterozygote eNOS Knock-out war mit der Ausprägung spezifischer phänotypischer Veränderungen des Glukosestoffwechsels und der Leber assoziiert. Grundsätzlich waren bei maternal und paternal induzierter Programmierung geschlechtsspezifische Effekte zu beobachten. Hinsichtlich molekularer Ursachen dringt die Studie nur bis zur Ebene einiger differentiell exprimierter Kandidatengene vor. Epigenetische Untersuchungen könnten zum weiteren ursächlichen Verständnis beitragen.Background: The Advanced Fetal Programming Hypothesis proposes that maternal genes are regulative factors of fetal growth and disease risk in later life. NO is an important regulator of utero-placentar blood flow and has an influence on intrauterine growth. Intrauterine growth retardation is associated with insulin resistance in later life. Maternal heterozygous eNOS deficiency could therefore lead to intrauterine programming of alterations in glucose metabolism in wild type offspring. Additionally, it is also known that effects of fetal programming occur along the paternal line. Methods: In a mouse model, 134 wild type mice with a heterozygous eNOS deficient mother or father were observed during a period of 25 weeks. Phenotypical differences to wild type mice with a wild type background were analyzed. Animal body weights were measured up to week 20, blood was taken for fasting blood glucose measurements in week 3, 17 and 21. An intra-peritoneal glucose tolerance test (ipGTT) was performed in week 24. Insulin concentrations were measured in week 17 and 21, as well as during ipGTT. Liver weights were analyzed. Histologically, liver lobule dimensions were analyzed in H.E. staining, lipid content was morphometrically measured by Oil Red O staining. Liver glycogen content was measured by amyloglucosidase method. Expression of candidate genes involved in hepatic glucose and lipid metabolism were analyzed by rtPCR. In week 12, 18 and 23 animals were placed in metabolic cages for measurement of kidney function. Blood pressure was measured by tail cuff method in weeks 10, 19 and 24. Results: Birth weight in animals born to heterozygous eNOS deficient mothers was significantly lower. In sex specific analysis, birth weight reduction was only significant in male mice. Weight differences at birth were lost postnatally, and animals of this group showed significantly higher body weights day 13 through 32. Female mice were significantly heavier even thereafter. Hepatic lipid accumulation was present in mice born to heterozygous eNOS deficient mothers, especially in females, the latter also showing significantly higher absolute liver weight. In week 21 mice of this group had significantly lower fasting blood glucose concentrations and showed a trend towards lower insulin concentrations (p=0,054 vs. mother WT/father WT). During ipGTT in week 24, animals to heterozygous eNOS deficient mothers showed significantly higher glucose concentrations after 15 minutes, as well as a significantly higher AUC for glucose. Animals born to fathers with heterozygous eNOS deficiency did not show any differences in birth weight, compared to the control group. During day 11 through 34 animals of this group showed significantly higher body weights, female mice even thereafter. In week 21, mice of this group showed significantly higher fasting blood glucose concentrations. Male mice also showed significantly higher insulin concentrations in week 17. During ipGTT animals to heterozygous eNOS deficient fathers showed the significantly highest insulin concentrations. Sex-specific analysis showed these alteration only in males. Hepatic lipid and glycogen content was significantly higher in these animals; in sex- specific analysis the former was highest in female animals, the latter in male animals. Expression analysis of candidate genes showed evidence of differential expression patterns. In regard to other phenotypical characteristics, no significant differences were observed. Conclusion: The experiment showed that heterozygous eNOS deficiency is associated with lower birthweight in wild type offspring, according to the advanced fetal programming hypothesis. In conclusion, the advanced fetal programming hypothesis could be confirmed for maternal heterozygous eNOS deficiency in a mouse model. Paternal heterozygous eNOS deficiency was also associated with development of a specific hepatic and metabolic phenotype. Sex-specific effects were present. In regard to underlying molecular mechanisms, the present study shows evidence of differential expression in few genes. Further analysis, especially in regard to epigenetic mechanisms, could contribute to a further understanding