The role of chaperones and proteases in heat-induced protein aggregation and stress response in Bacillus subtilis.

Durch Hitze ausgelöster Stress führt zur Fehlfaltung und Aggregation von zellulären Proteinen. Inwiefern das Proteinqualitätskontrollsystem bestehend aus Proteasen und Chaperonen das Gleichgewicht zwischen gefalteten und beschädigten, fehlgefalteten oder sogar aggregierten Proteinen unter Hitzestressbedingungen wiederherstellt, ist von großem Interesse. In diesem Sinne wurde in dem Modellorganismus Bacillus subtilis die Thermotoleranzentwicklung im Hinblick auf die Entstehung von Proteinaggregaten in stark hitzegestressten Zellen, die zuvor einem milden Hitzeschock ausgesetzt worden waren, untersucht. Zellen, in denen das ClpXP-Proteasesystem fehlte, wiesen deutlich weniger hitze-induzierte Proteinaggregate auf, während Chaperone wie DnaK oder die AAA+ ATPase ClpC nur wenig Einfluss darauf hatten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Spx, der durch das ClpXP Proteasesystem reguliert wird, eine bedeutende Rolle für die Thermotoleranzentwicklung spielt, indem er die Expression redoxaktiver Enzyme, wie zum Beispiel Thioredoxin veranlasst. Demzufolge waren anaerob wachsende B. subtilis Zellen unter starker Hitzeeinwirkung weniger anfällig gegenüber Proteinaggregation als Zellen, die Sauerstoff ausgesetzt waren. Die hier gezeigten Daten sprechen dafür, dass der Schutz fehlgefalteter Proteine vor Oxidation eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung der Proteinaggregation unter Hitzestress spielt. Molekulare Chaperone, wie zum Beispiel Hsp90, scheinen in Eukaryoten eine bedeutenden Einfluss auf die Evolution zu haben, indem sie in der Lage sind als genetischer Puffer zu agieren, um Organismen trotz genetischer Variation eine normale Entwicklung zu ermöglichen. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit bestand darin, das Chaperon HtpG aus B. subtilis, welches das bakterielle Homolog zu Hsp90 darstellt, genauer zu betrachten und im Hinblick auf seine Rolle in evolutionären Prozessen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die gleichzeitige Anwesenheit von HtpG und ClpC notwendig für die Aufrechterhaltung des Wachstums sowohl unter normalen, als auch unter Hitzestressbedingungen ist. Wechselwirkungen konnten jedoch nicht mit ClpC, dafür mit Stoffwechselproteinen, mit ribosomalen Proteinen, Triggerfaktor und der RNA- Polymerase nachgewiesen werden. Ein Einfluss von HtpG auf die Adaptation an einen bestimmten exogenen oder endogenen Stress konnte nicht eindeutig bestimmt werden. Auch wurde ausgeschlossen, dass HtpG Auswirkungen auf bistabile Systeme in B. subtilis hat. Mit den hier gezeigten Ergebnissen ist eine endgültige Aussage über die Bedeutung von HtpG in B. subtilis und dementsprechend dessen Rolle in evolutionären Prozessen ohne weitere Studien nicht möglich.Heat induced stress leads to misfolding and aggregation of cellular proteins. It is of great interest how the quality control system, consisting of proteases and chaperones, restores the balance between folded and damaged, misfolded or even aggregated proteins under heat stress conditions. According to that, thermotolerance development regarding the formation of protein aggregates in severely heat shocked cells primed by a mild heat shock, using Bacillus subtilis as model organism, was examined. Cells lacking the ClpXP protease system showed significantly less heat induced protein aggregates whereas chaperones like DnaK or the AAA+ ATPase ClpC revealed only little influence. In this thesis it was confirmed that the transcription factor Spx, regulated by ClpXP, is important for thermotolerance development by initiating the expression of redoxactive enzymes, such as thioredoxin. Consequently, B. subtilis cells growing anaerobic were less vulnerable to protein aggregation under severe heat stress than cells exposed to oxygen. The presented data suggest that protection of misfolded proteins from thiol oxidation during heat stress plays a significant role in prevention of protein aggregation. Within eukaryotes, molecular chaperons like Hsp90, seem to greatly influence evolutionary processes evolution by acting as a genetic buffer to enable organisms having a normal development despite of genetic variation. Another aspect of this work was the analysis of the chaperone HtpG in B. subtilis, which is the bacterial homolog to Hsp90 and studying its impact on evolutionary processes. It was shown that the simultaneous presence of HtpG and ClpC is necessary for maintaining growth under normal as well as heat stress conditions. However, no interaction was revealed with ClpC but with housekeeping and ribosomal proteins, trigger factor and RNA polymerase. An influence of HtpG on the adaptation to a distinct exogenic and endogenic stress could not be clearly determined. Also, HtpG playing a role in bistable systems was excluded. In conjunction with the presented results, a conclusive statement about the significance of HtpG for the bacterial cell and accordingly its role regarding evolutionary processes in B. subtilis can't be made without further study