Synthese und immunologische Evaluation von Oligosaccharidantigenen als Impfstoffkandidaten für Streptococcus pneumoniae Serotypen 1 und 8

Table of Contents 1 List of Abbreviations 5 List of Monosaccharides 7 Summary 9 Zusammenfassung 11 1 Introduction 1.1 Streptococcus pneumoniae 15 1.1.1 Pneumococcal Disease 15 1.1.2 Pneumococcal Capsules as Virulence Factors 16 1.2 Carbohydrate-based Vaccines 17 1.2.1 Bacterial Capsular Polysaccharides as Vaccine Candidates 18 1.2.2 Immunology of Carbohydrate-based Vaccines 19 1.2.3 Antibodies and Their Role in Pneumococcal Disease 22 1.2.4 Production and Manufacture of Glycoconjugate Vaccines 24 1.3 Opportunities and Challenges of Vaccines Based on Synthetic Oligosaccharides 24 1.3.1 Chemical Immunology of Synthetic Oligosaccharides 26 1.3.1.1 The Effect of Saccharide Length 26 1.3.1.2 The Effect of Exposed Epitopes 27 1.3.1.3 The Immunomodulatory Properties of Zwitterionic Polysaccharides 27 1.4 Novel Developments in Vaccine Design 28 1.4.1 Rational Vaccine Design 29 1.4.2 Epitope Discovery as a Driving Force in Vaccine Development 30 1.4.2.1 Glycan Microarrays 30 1.4.2.2 Surface Plasmon Resonance 31 1.4.3 Liposomes as Novel Carrier Platforms 32 1.5 Organic Chemistry Approaches to Manufacturing Oligosaccharide-based Vaccines 33 1.5.1 The Glycosylation Reaction as a Key Transformation in Carbohydrate Synthesis 33 1.5.2 Challenges Associated with the Synthesis of Zwitterionic Polysaccharide Fragments 35 1.5.3 Stereoselectivity of Glycosylation Reactions 36 1.6 Aims of This Thesis 39 2 Synthesis and Immunological Evaluation of Conjugation-ready Zwitterionic Oligosaccharides 2.1 Introduction 41 2.1.1 Commensal Bacteria 41 2.1.2 Zwitterionic Polysaccharides 42 2.1.3 Streptococcus pneumoniae Serotype 1 43 2.1.4 Conjugation-Ready Zwitterionic Oligosaccharides 44 2.1.5 Liposomal Display of Antigen-Adjuvant Systems as Promising Vaccine Formulations 45 2.2 Results 46 2.2.1 Development of a Chemoselective Thioglycoside Activation Strategy 46 2.2.2 Total Synthesis of a Conjugation-ready Sp1 Repeating Unit Trisaccharide 50 2.2.3 Total Synthesis of a Conjugation-Ready PS A1 Repeating Unit Tetrasaccharide 56 2.2.4 Synthesis of Conjugation-ready ZPS Repeating Unit Fragments 60 2.2.5 Recognition of Synthetic ZPS Fragments by Components of the Immune System 62 2.2.6 Evaluation of the Immune Response Against D-AAT 63 2.2.7 Evaluation of an Sp1 Trisaccharide Repeating Unit as a Vaccine Hapten Against Streptococcus pneumoniae Serotype 1 66 2.2.8 Liposomal Presentation of a Sp1 Trisaccharide as a Fully Synthetic Antigen Formulation 69 2.3 Conclusion and Outlook 71 2.5 Experimental Section 75 2.5.1 Methods of Synthetic Chemistry 75 2.5.2 Methods of Biochemistry 127 3 Reverse Engineering of Antibodies Against Streptococcus pneumoniae Serotype 8 Capsular Polysaccharide Using Synthetic Oligosaccharides 3.1 Introduction 133 3.1.1 Streptococcus pneumoniae Serotype 8 133 3.1.2 Serotype 8 Capsular Polysaccharide 134 3.1.3 The Relevance of Monoclonal Antibodies Against Serotype 8 135 3.1.4 Reverse Engineering of Antibodies as a Concept of Vaccine Design 135 3.2 Results 137 3.2.1 Glycotope Mapping of ST8-recognizing Antibody Samples 137 3.2.2 An Optimized Chemical Synthesis of ST8 Frameshift C 139 3.2.3 Evaluation of the Immune Response Against Synthetic ST8 Frameshifts A and C 143 3.2.4 Monoclonal Antibodies Against ST8 Frameshift C Bind to Internal Glycotopes of Native ST8 Polysaccharide 148 3.2.5 Monoclonal Antibodies Against ST8 Frameshift C Bind Serotype 8 Pneumococci and Protect from Lethal Pneumococcal Infection 152 3.2.5.1 Binding of Serotype 8 Pneumococci 152 3.2.5.2 Opsonophagocytic Killing 152 3.2.5.3 Passive Immunization 153 3.2.6 Synthesis of Oligosaccharides Related to ST8 Frameshift C 154 3.2.7 Mapping of Protective and Non-protective Glycotopes Within ST8 Frameshift C 160 3.7.2.1 Mapping a Non-protective Glycotope Within ST8 Frameshift C 160 3.7.2.2 The Protective Glycotope Within ST8 Frameshift C Does not Include the Terminal Glucuronic Acid 162 3.2.8 Mapping the Glycan Binding Characteristics of Opsonizing and Agglutinating mAbs Against ST8 CPS 165 3.3 Conclusion and Outlook 169 3.3.1 Elucidation of a Protective Glycotope of ST8 CPS 169 3.3.2 Characterization of Glycan Binding Properties of Opsonizing and Agglutinating Monoclonal Antibodies Against ST8 172 3.5 Experimental Section 174 3.5.1 Methods of Synthetic Chemistry 174 3.4.2 Methods of Biochemistry 199 4.1 Introduction 207 4.2 Results 209 4.2.1 Design of Linker Alcohols with Distinct O-Nucleophilicities 209 4.2.2 Impact of O-Nucleophilicity on the Stereoselectivity of Glycosylation Reactions 210 4.3 Conclusion and Outlook 214 4.4 Experimental Section 217 Bibliography 223 Curriculum Vitae 239Carbohydrate-based vaccines have successfully prevented infectious diseases in the last decades. To date, several vaccines based on isolated capsular polysaccharides (CPSs) are marketed against pathogenic bacteria such as Streptococcus pneumoniae. The manufacture of these vaccines still suffers from shortfalls associated with the isolation of CPSs from natural sources. Furthermore, limited protectiveness of certain CPS antigens hampers vaccine efficiency. Synthetic, structurally defined oligosaccharides present an important alternative, with great potential to understand glycan immunology and rationally engineer efficacious antigens. To that end, strategies are needed to facilitate the streamlined design and generation of these antigens. Novel synthetic methods fuel oligosaccharide assembly. Strategies to reverse engineer antibodies enable the rational antigen design. Concomitantly, optimizing the vaccine formulation helps to fine-tune the immune responses elicited by oligosaccharide antigens. This work combines the development of strategies in organic chemistry and biochemistry with in vivo immunological evaluations to provide insight into the nature of optimized carbohydrate-based vaccines against S. pneumoniae. Zwitterionic polysaccharides (ZPSs) have gained attention due to their immunomodulatory properties that may render these structures interesting vaccine components. The ZPS representative Sp1 is an attractive vaccine target against S. pneumoniae serotype 1 (ST1) that is, in turn, insufficiently covered by existing vaccines. The first part of this work (Chapter 2) emcompasses the development of a chemoselective thioglycoside activation method in the presence of thioethers that allowed for the first total syntheses of conjugation-ready ZPS fragments. Glycan microarray analysis of serum samples along with immunological evaluation in mice gave insights into the immune recognition of conjugation-ready ZPS fragments. Finally, the potency of a synthetic Sp1 trisaccharide as a vaccine antigen against ST1 was evaluated in vivo. To facilitate the creation of next-generation vaccines, strategies are needed to rationally design oligosaccharide antigens based on first principles. Highly virulent S. pneumoniae serotype 8 (ST8) is not included in modern conjugate vaccine formulations, and synthetic precedence on ST8-derived oligosaccharides is scarce. The second part of this work (Chapter 3) comprises the elucidation of an oligosaccharide substructure that confers protective immunity against ST8 CPS. A newly-designed, divergent synthetic route provided access to a collection of ST8-related oligosaccharides. These and other glycans were used to reverse-engineer a protective ST8 CPS-directed monoclonal antibody (mAb) by glycan microarray analysis. A distinct tetrasaccharide frameshift was found to harbor both protective and non- protective, immunodominant glycotopes, and a murine mAb raised against this frameshift protected mice from lethal pneumococcal infection. The molecular details that govern different in vitro phenotypes of bacterial recognition by a set of ST8 CPS-directed mAbs were investigated. Despite the progress in the development of vaccine antigens based on synthetic oligosaccharides, several shortcomings are still associated with the generation of glycosidic bonds. Particularly, the 1,2-cis-stereoselective introduction of N-protected, amino alcohol-derived linkers at the reducing end of oligosaccharides remains a major challenge. Chapter 4 features the development of a linker that can be introduced into synthetic oligosaccharides with excellent 1,2-cis- selectivities. Lowering the O-nucleophilicity of a conventional, aliphatic linker by introducing two fluorine substituents leads to a striking increase of 1,2-cis-selectivities in glycosylation reactions. This effect is consistent over a wide range of reaction conditions and facilitates the generation of synthetic oligosaccharide antigens.Mittels kohlenhydratbasierter Impfstoffe konnte in den vergangenen Jahrzehnten eine Vielzahl von Infektionskrankheiten verhindert werden. Eine Reihe kommerziell erhältlicher Präparate beruht auf Kapselpolysacchariden pathogener Bakterien wie Streptococcus pneumoniae. Allerdings ist die Produktion dieser Impfstoffe oftmals aufwändig. Darüber hinaus sind bestimmte Polysaccharidantigene nicht in der Lage, einen ausreichenden Impfschutz hervorzurufen. Synthetische, strukturell definierte Oligosaccharide sind ein vielversprechender Ansatz, um einerseits die Immunreaktionen des Körpers gegen Zuckerstrukturen zu verstehen und andererseits hochwirksame Antigene gezielt darszustellen. Allerdings müssen sowohl Entdeckung als auch Herstellung dieser Antigene vereinfacht werden, was die Verbesserung bestehender Verfahren und die Entwicklung neuer Herangehensweisen auf mehreren Ebenen erfordert. Innovative Synthesemethoden sind zum einen essentiell zum Aufbau komplexer Oligosaccharide. Der zielgerichteten Antigenentwicklung dient zum anderen die Rekonstruktion von Antikörper-Kohlenhydrat-Interaktionen. Darüber hinaus ermöglichen neue Methoden der Impfstoffformulierung die Optimierung der Immunantwort gegen ein Oligosaccharidantigen. Diese Arbeit verbindet neuartige Strategien der organisch-chemischen Synthese und der Biochemie mit immunologischer Evaluierung synthetischer Antigene in vivo, um Aufschluss über die Charakteristika optimierter Kohlenhydratimpfstoffe gegen S. pneumoniae zu erhalten. Zwitterionische Polysaccharide (ZPSs) sind auf Grund ihrer immunmodulierenden Eigenschaften für den Einsatz in Impfstoffen von Interesse. Das ZPS-Molekül Sp1 ist darüber hinaus eine wichtige Zielstruktur zur Impfstoffentwicklung gegen S. pneumoniae Serotyp 1 (ST1), einem Stamm, der von existierenden Impfstoffen nur unzureichend abgedeckt wird. Der erste Teil dieser Arbeit (Kapitel 2) behandelt die Entwicklung einer Methode zur chemoselektiven Aktivierung von Thioglycosiden in Anwesenheit von Thioethern. Mit Hilfe dieser Methode konnte die erste Totalsynthese konjugierbarer ZPS- Substrukturen realisiert werden. Durch Glycan-Microarray-Analyse sowie immunologische Evaluierung im Mausmodell konnte Aufschluss über die Erkennung der ZPS-Fragmente durch Komponenten des Immunsystems erhalten werden. Schließlich wurde die Eignung eines synthetischen Sp1-Trisaccharids als Impfstoffkandidat gegen ST1 in vivo untersucht. Zur Erforschung neuartiger Impfstoffe werden Methoden benötigt, um Oligosaccharidantigene zielgerichtet auf Basis weniger Grundprinzipien zu entwerfen. Obwohl der hochvirulente S. pneumoniae Serotyp 8 (ST8) kein Bestandteil kommerziell erhältlicher Kohlenhydrat-Protein-Konjugatimpfstoffe ist, behandeln nur sehr wenige Vorarbeiten die Synthese von ST8-basierten Oligosacchariden. Der zweite Teil dieser Arbeit (Kapitel 3) beschreibt die Entdeckung einer Oligosaccharidstruktur, die eine protektive Immunantwort gegen ST8 CPS hervorzurufen vermag („protektives Glycotop“). Mit Hilfe einer neu entworfenen, divergenten Synthesestrategie wurde eine Reihe ST8-abgeleiteter Oligosaccharide hergestellt und zusammen mit anderen verfügbaren Glycanstrukturen dazu verwendet, das Bindungsmuster eines protektiven, ST8 -Kapselpolysaccharid-gerichteten, monoklonalen Antikörpers (mAk) zu rekonstruieren. Dabei stellte sich heraus, dass eine spezielle Tetrasaccharidstruktur sowohl protektive als auch immunodominante, nichtprotektive Glycotope enthält. Ein in Mäusen durch Immunisierung mit einem entsprechenden Glycokonjugat hergestellter mAk gegen dieses Tetrasaccharid schützte Mäuse vor einer tödlichen Infektionsdosis mit Pneumokokken. Außerdem wurden die molekularen Grundlagen untersucht, die zu Unterschieden in der Bakterienerkennung durch verschiedene mAks in vitro führen. Dieser Teil der Arbeit beschreibt eine gegenüber herkömmlichen Herangehensweisen stark vereinfachte Strategie zur zielgerichteten Entwicklung oligosaccharidbasierter Impfstoffantigene. Trotz großer Fortschritte bei der Entwicklung von Impfstoffantigenen auf Basis synthetischer Oligosacccharide bestehen noch immer große Probleme mit deren organisch-chemischer Synthese, insbesondere mit der Knüpfung glycosidischer Bindungen. Vor allem die 1,2-cis-stereoselektive Einführung N-geschützter Aminoalkohole, die als Linker der späteren chemoselektiven Konjugation des ungeschützten Glycans dienen, stellt eine große synthetische Herausforderung dar. In Kapitel 4 wird die Entwicklung eines neuartigen Linkers beschrieben, der sich mit ausgezeichneten 1,2-cis- Stereoselektivitäten in synthetische Oligosaccharide einbringen lässt. Durch Einführung von zwei Fluorsubstituenten wurde die O-Nukleophilie eines herkömmlichen, aliphatischen Linkers stark herabgesetzt, was zu einer beachtlichen Erhöhung der 1,2-cis-Selektivitäten in Glykosylierungsreaktionen führte. Dieser Effekt zeigte sich für eine große Bandbreite an Reaktionsbedingungen und sollte daher die Herstellung von konjugierbaren Oligosaccharidantigenen in Zukunft wesentlich vereinfachen