Construction and characterization of recombinant antibody fragments against HLA class I molecules

Titlepage, Contents Einleitung Material Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung LiteraturverzeichnisIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein single chain (sc) Fv-Fragment des HLA-B35-spezifischen,Peptid-abhängigen monoklonalen Antikörpers (mAk) TÜ165 untersucht. Dieser mAk reagiert mit HLA-B35-exprimierendenZellen nur dann, wenn sie mit EBV infiziert sind, und weist dadurch T-Zell-Rezeptor-ähnliche Eigenschaften auf. Außerdemwurde eine semi-synthetische Phagenbibliothek auf Zellen mit dem Ziel selektioniert, HLA-Klasse-I-spezifischescFv-Fragmente zu isolieren. Die Ergebnisse der Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen:· Der monoklonale Antikörper TÜ165 wurde molekularbiologisch charakterisiert. Dafür wurden die VH- und VL-Fragmentedes Antikörpers mit Hilfe eigens konstruierter PCR-Primer amplifiziert. So konnte die Primärstruktur der variablen Regionbestimmt und der Antikörper klassifiziert werden: die schwere µ-Kette wurde zur Gruppe Ib und die leichte k -Kette zurGruppe Vk 9 zugeordnet.· Ein scFv-Fragment des Antikörpers TÜ165 wurde konstruiert und in E.coli exprimiert. Die Bedingungen der Expressionwurden optimiert. Da das Fragment in Form von periplasmatischen inclusion bodies abgelagert wurde, mußte zur Reinigungein Renaturierungsverfahren angewandt werden. Die Spezifität des scFv-Fragments wurde mit Hilfe humaner HLA-typisierterZellinien untersucht. Dabei erwies sich, daß das TÜ165-scFv-Fragment spezifisch mit HLA-B35-positiven Zellen reagiert. ImGegensatz zum mAk war die Reaktivität des scFv-Fragments jedoch nicht von der Gegenwart bestimmter Peptide in derPeptid- bindenden Spalte des HLA-B35-Moleküls abhängig. Die Spezifität des Fragments ist somit nicht identisch mit der desmAk TÜ165.· Die ursprünglich vorgesehene Erarbeitung eines Modellsystems auf der Basis von TÜ165-scFv-Fragmenten zur Selektioneiner Phagenbibliothek mit Zellen war daher nicht möglich. Zur Selektion für HLA-B35-Phagen wurde eine semi-synthetischePhagenbibliothek (Nissim-library) mit fixierten BM28.7-Zellen (HLA-A1, B35, Bw6) inkubiert. Um Reaktionen mit anderenZellmembranmolekülen auszuschließen, mußte die Bibliothek mit fixierten BM19.7-Zellen (HLA-A2, B13, Bw4) präinkubiertwerden. Es gelang, nach insgesamt vier Selektionsrunden eine Phagenpopulation mit Klonen anzureichern, die im ELISA einebevorzugte Bindung an BM28.7-Zellen zeigten. Keiner der analysierten Klone reagierte allerdings ausschließlich mit dieserZellinie. Die löslichen scFv-Fragmente von vier ausgesuchten Klonen wurden auf ihre Reaktion mit menschlichenHLA-typisierten Zellinien hin mit Hilfe der Durchflußzytometrie untersucht. Die erhoffte hohe Spezifität der scFv-Fragmenteließ sich jedoch mit dem gewählten Selektionssystem nicht erreichen.In the present work single chain fragments (scFv) of the HLA B35-specific, peptide dependent monoclonal antibody TÜ165were studied. This monoclonal antibody interacts with cells expressing HLA only if they are infected with the Epstein Barrvirus and has thus a certain similarity to T-cell receptors. Moreover, a semi-synthetic phage library was selected with cells (human, HLA typified) in order to obtain HLA class Ispecific scFv. The results can be summarised as follows: The monoclonal antibody TÜ165 was characterised. To this aim the VH and VL fragments of the antibody were amplified by means of specially constructed PCR primers. As a consequence the primary structure of the variable domain was determined and the antibody was classified: the heavy m -chain was found to belong to group 1b and the light k -chain was classified as inhering to group Vk 9. A scFv fragment of the antibody TÜ165 was constructed and expressed in E. coli. The expression conditions were optimised. As the fragment accumulated in the form of periplasmatic inclusion bodies a renaturation method had to be applied for protein purification. The specificity of the scFv fragment was investigated using human HLA typified cell lines. It was proven that the TÜ165 scFv fragment specifically binds to HLA B35-positive cells. However, in contrary to the monoclonal antibody the reactivity of the scFv fragment does not depend on the presence of certain peptides in the peptide-binding site of the HLA B35 molecule. Thus the specificity of the fragment is not identical with that of the monoclonal antibody TÜ165. Originally it was our intention to establish a model system based on TÜ165 scFv fragments for the selection of a phage library. We did not succeed in this objective. For the selection of HLA B35 specific phages a semi-synthetic library (Nissim library) was incubated with immobilised BM28.7 cells (HLA-A1, B35, and Bw6). In order to exclude reactions with other cell surface molecules the library was pre-incubated with immobilised BM19.7 cells (HLA-A2, B13, and Bw4). After in total 4 selection rounds a phage population was enriched which showed a preferential binding to BM28.7 cells. However, none of the analysed clones interact exclusively with this cell line. The soluble scFv fragments of 4 selected clones were tested towards their reaction with human HLA typified cell lines applying flow cytometry. The awaited high specificity could not be reached with the chosen selection system