Investigations on the influence of phytogenic additives on digestive physiological, microbiological and immunological parameters in weaned piglets

Die vorliegende Studie wurde zur Evaluierung moglicher Effekte eines auf einer Pflanzenmischung basierenden Futterzusatzstoffes und zwei weiteren pflanzlichen Komponenten (Bockshornkleesamen und Susholzwurzel) auf einen enteropathogenen Escherichia (E.) coli-Stamm durchgeführt. Des Weiteren sollten mögliche Effekte auf die intestinale Mikrobiota und das Immunsystem bei abgesetzten Ferkeln überprüft werden. Zur Ermittlung möglicher antiadhäsiver Effekte gegenüber einem enteropathogenen E. coli-Stamm erfolgten durchflusszytometrische Untersuchungen in einem in vitro-Infektionsmodell mit einer IPEC-J2-Zelllinie. Ergänzend wurden Untersuchungen zur Bildungskapazität der Pflanzenmaterialien an den E. coli-Stamm durch Ermittlung des bakteriellen Wachstums der an die auf einer Mikrotiterplatte beschichteten Pflanzenmaterialien gebundenen Bakterien durchgeführt. Für die Ermittlung antimikrobieller Effekte Gegenuber dem E. coli-Stamm wurde das Wachstum der Bakterien unter dem Einfluss verschiedener Konzentrationen der Pflanzenmaterialien ermittelt. Anschließend wurde ein Fütterungsversuch mit insgesamt 48 männlichen kastrierten Ferkeln in drei Versuchsdurchgangen durchgeführt. Die Ferkel wurden in jedem Durchgang gleichmäßig auf vier Fütterungsgruppen aufgeteilt, sodass pro Versuchsdurchgang jeder Fütterungsgruppe vier Ferkel zugeordnet werden konnten. Alle Tiere erhielten ein bedarfsdeckend zusammengesetztes Alleinfutter für Ferkel, dem in der Versuchsgruppe B 0,04% FRESTAR F zugesetzt wurden, Versuchsgruppe C erhielt 0,2% FRESTAR F und Versuchsgruppe D 0,15% Bockshornkleesamenpulver. Am fünften und 19. Versuchstag wurden die Ferkel oral mit einem Lebendimpfstoff (SALMOPORCR, Firma IDT) gegen Salmonella Typhimurium vakziniert, um einen möglichen Einfluss auf die Ausbildung spezifischer Antikörper im Serum zu ermitteln. Am 28. und 29. Versuchstag wurden Blut- und Darmproben sowie Digestaproben aus dem Duodenum, proximalen und distalen Jejunum, Ileum, Zäkum und Kolon entnommen. Neben zootechnischen Daten (Lebendmasse, Tageszunahmen, Futteraufnahme und Futteraufwand) wurden die scheinbare Verdaulichkeit des Rohproteins, der intestinale pH-Wert und der Trockensubstanzgehalt der Digesta untersucht. Einflusse der pflanzlichen Zusatzstoffe auf die intestinale Mikrobiota wurden anhand der bakteriellen Metaboliten (Laktat, kurzkettige Fettsauren) bestimmt. Zur Ermittlung immunmodulatorischer Einflusse erfolgten durchflusszytometrische Bestimmungen zur Phanotypisierung der Leukozyten aus dem Blut und der Lamina epithelialis des proximalen Jejunums. Des Weiteren wurde die Phagozytoseaktivitat isolierter peripherer Mono- und Granulozyten mittels opsonierter E. coli (PhagotestR) im Durchflusszytometer gemessen. Zur Beurteilung der Proliferationsleistung der Lymphozyten aus dem Blut der Tiere wurden diese mit den Mitogenen Pokeweed Mitogen (PWM), Concanavalin A (Con A) und Phythamagglutinin M (PHA-M) stimuliert. Die Haptoglobingehalte und spezifischen Immunglobulingehalte gegen Salmonella Typhimurium im Serum wurden mit Hilfe von Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) ermittelt. In den in vitro-Untersuchungen konnte eine verminderte Adhäsion eines enteropathogenen Escherichia coli-Stamms an eine intestinale Epithelzelllinie (IPEC-J2) durch den Einsatz der Pflanzenmaterialien ermittelt werden. Dabei reduzierte sich die relative Fluoreszenzintensiät der markierten adhärierten E. coli an den Epithelzellen unter dem Einfluss von FRESTAR F um 52,7%, unter dem Einfluss von Bockshornkleesamen um 57,6%. Außerdem zeigten sich Bildungskapazitäten der pflanzlichen Substanzen gegenüber dem E. coli-Stamm Antimikrobielle Effekte der eingesetzten Pflanzenmaterialien konnten in vitro nicht nachgewiesen werden. In den Fütterungsversuchen zeigten sich keine Effekte von FRESTAR F und Bockshornkleesamen auf die zootechnischen Parameter. Durch den Einsatz der pflanzlichen Zusatzstoffe reduzierte sich der pH-Wert im Bereich des distalen Jejunums, des Ileums, Zäkums und Kolons (p<0,05) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Während der Einsatz von 0,2% FRESTAR F zu einer Zunahme der Azetatkonzentration im Ileum fuhrte (p< 0,05), konnte durch den Einsatz von Bockshornkleesamen eine Abnahme der Azetatkonzentration ermittelt werden (p< 0,05). Gleichzeitig wurden durch den Einsatz von Bockshornkleesamen erhöhte Propionat-, Butyrat- und Valeriansäurekonzentrationen im Ileum gemessen (p> 0,05). Es zeigten sich auch numerische Effekte der Zusatze auf die Laktatkonzentration im Dünn- und Dickdarm. Die immunologischen Parameter zeigten einen Einfluss von Bockshornkleesamen auf den relativen Anteil der γδ-T-Zellen (TCR+CD8α-) und der antigenpräsentierenden Zellen (MHCII+CD5-) im Blut der Ferkel (p< 0,05). Während der relative Anteil der γδ-T-Zellen in der Kontrollgruppe bei 9,4% (3,92-20,7) lag, erhöhte sich dieser durch den Einsatz von Bockshornkleesamen auf 17,2% (7,28-35,0). Für die antigenpräsentierenden Zellen zeigte sich ein Abfall des relativen Anteils von 30,5% (11,2- 43,4) in der Kontrollgruppe auf 20,9% (16,4-36,0) in der Bockshornkleesamen-Gruppe. Alle anderen immunologischen Parameter blieben durch den Einsatz der Zusatzstoffe unbeeinflusst. Es zeigten sich keine Effekte der Futterzusammensetzung auf die Lymphozytenproliferation, die Phagozytoseaktivitat der neutrophilen Granulozyten und Monozyten sowie die Antikörperbildung nach oraler Vakzinierung gegen Salmonellen. Anhand der vorliegenden Ergebnisse lasst sich schlussfolgern, dass die geprüften Zusatze im Intestinaltrakt von Ferkeln Einfluss auf die Adhäsion pathogener Escherichia coli-Stamme an Enterozyten sowie auf die Zusammensetzung und metabolischen Aktivitäten der intestinalen Mikrobiota haben. Es sollten weiterführende Untersuchungen zur Abklärung des antiadhäsiven Potenzials im Tier und zur konkreteren Beurteilung der Bedeutung der ermittelten immunmodulatorischen Einflusse durchgeführt werden.The present study was performed to evaluate potential effects of a mixed phytogenic feed additive (FRESTAR F) and two further components (fenugreek seeds and liquorice roots) on a porcine enteropathogenic Eschericha coli- strain. Furthermore, potential effects on the intestinal microbiota and the immune system of weaned piglets were validated. To establish possible anti- adhesive effects of the phytogenic additives to an enteropathogenic E. coli- strain, porcine jejunal epithelial cells (IPEC-J2) marked by fluorescent dye were examed in a flow cytometry. Additionally the bond capacity of the phytogenic additives towards the E. coli–strain was detected by measuring bacterial growth rate. Antimicrobial influences were investigated by incubating the bacteria with the test materials at different concentrations and measuring the bacterial growth rate. After the in vitro investigations a feeding trial with 48 male castrated piglets was performed for 28 days. The piglets were divided into four groups, which all received a standard piglet diet covering the piglets`needs. For control group A no additive was applicated, the diet for group B was supplemented with 0.04% FRESTAR F, in diet C 0.2% FRESTAR F was added and the diet for group D was supplemented with 0.15% fenugreek seeds. The piglets were vaccinated with a live vaccine against Salmonella Typhimurium (SALMOPORCR, IDT) to investigate the influence on development of specific antibody titers. Blood and tissue samples of the proximal jejunum were taken and the digesta of the duodenum, proximal and distal jejunum, ileum, caecum and colon were collected. Beside zootechnical parameters the apparent digestibility of crude protein, the pH-value and dry matter content of the digesta were measured. The digesta samples were also tested for the impact of FRESTAR F and fenugreek seeds on the intestinal bacterial metabolites such as lactate and short chain fatty acids. For immunomodulatory investigations, flow cytometric analyses were realised to characterise various immune cell populations in the blood and in the lamina epithelialis of the proximal jejunum. The phagocytic activity of isolated monocytes and granulocytes was analysed by PhagotestR. The proliferation behaviour of peripherial blood lymphocytes was measured after stimulation with pokeweed mitogen, Concanavalin A and Phythaemagglutinin M. Serum concentrations of haptoglobin and Salmonella antibody titers were determined with the help of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA). The in vitro investigations could demonstrate potential anti-adhesive effects of the phytogenic feed additives on the enteropathogenic E. coli-strain. As a result of this the relative fluorescence intensity of adhered bacteria to the epithelial cells (IPEC-J2) was reduced. Inclusion of FRESTAR F resulted in a reduction of 52.7%, whereas the addition of fenugreek seeds led to a reduction of 57.6%. No antimicrobial effects for the utilised phytogenic products could be proved. Health status and zootechnical parameters of the piglets were not affected by the feed additives in the feeding trials. The pH-values in the distal jejunum, ileum, caecum and colon were significantly reduced by the phytogenics compared to the control group (p<0.05). The addition of 0.2% FRESTAR F led to an increase of the acetate concentration in the ileum (p<0.05). In contrast fenugreek seeds reduced the acetate concentration in the ileum significantly (p<0.05) but simultaneously increased slightly the concentrations of propionate, butyrate and valerian acid. The phytogenics did not affect the lactate concentration in the intestine significantly. The addition of fenugreek seeds increased the relative amount of the γδ-T-cell population (TCR1+CD8α-) in the blood with simultaneuos reduction of antigenpresenting cells (MHCII+CD5-) (p