Characterisation and validation of new target genes for innovative therapy concepts of bronchial asthma

Allergisches Asthma bronchiale (AB) ist zur häufigsten chronischen Atemwegs- Erkrankung geworden. Trotz aller Fortschritte bei der Behandlung von AB ist die Gesamt-Mortalität in den letzten Jahrzehnten leicht angestiegen wegen der starken Zunahme von Prävalenz und Inzidenz von AB. Die vorliegende Arbeit soll ein Beitrag leisten, das Verständnis von Krankheitsmechanismen bei der Entstehung von AB durch die funktionelle Analyse neuer Gene im Mausmodell zu erhöhen. Über 300 differenziell neue und relevante regulierte Gene konnten durch die Microarray Analyse identifiziert und eine Auswahl an Genen mittels qPCR validiert werden, die bei der Ausbildung der allergischen Atemwegsentzündung und AHR beteiligt sind. Aus den Microarray Analysen konnten 27 verschiedene Gene gefunden werden, die nach allergischer (OVA) Sensibilisierung und Provokation mindestens zweifach konsistent hochreguliert waren, und das in zwei verschiedenen, Mausstämmen (BALB/c und C57BL/6). Darunter fanden sich Gene, die mit inflammatorischen Prozessen in Verbindung zu bringen sind, wie z.B. GPX2, Arg1, Saa3, Mmp12 und Lcn2. Am Beispiel von Lipocalin (Lcn2) wurde die funktionelle Relevanz der verstärkten Genexpression überprüft, diese Ergebnisse sind ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Western-blot Analysen der bronchoalveolären Flüssigkeit (BALF) bestätigten direkt die biologische Relevanz der erhöhten Lcn2 mRNA Expression durch Nachweis einer erhöhten Translation und Produktion des sekretierten Proteins, Lipacalin-2. In dem Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung und AHR wurde der Einfluss der Lcn2-Expression auf die Hauptmerkmale des Krankheitsbildes von AB mit Hilfe von Wildtyp- und Lcn2-defizienten Mäusen (KO) untersucht. Genetische Lcn2-Defizienz führte zu einer signifikant stärkeren Ausprägung des asthmatischen Phänotyps im Mausmodell für akute Atemwegsentzündung (AI). Verglichen mit WT-Nachkommen zeigen Lcn2 KO-Mäuse einen erhöhten Zustrom eosinophiler Granulozyten und Lymphozyten nach allergischer Sensibilisierung und Provokation. Dagegen war die allergische Sensibilisierung nicht betroffen, die Produktion von Gesamt- und OVA- spezifischem IgE war in WT und KO-Mäusen gleich. Ein direkter Vergleich des Atemwegswiderstandes in der isoliert perfundierten und ventilierten Mauslunge von sensibilisierten und provozierten Mäusen als funktioneller Parameter zeigte einen signifikant höheren Widerstand in Lcn2 KO-Mäusen als in den korrespondierenden WT-Kontrollen. Gleichzeitig zeigte sich in histologischen Lungenschnitten, dass die genetische Lcn2 Defizienz in den KO-Mäusen zu signifikant geringerer pulmonaler Apoptose in vivo führte. Im akuten Modell der AI traten TUNEL+ positive Zellen in einer signifikant höheren Anzahl in WT-Mäusen auf als in Lcn2 KO-Mäusen. Analysen der TUNEL+ positiven Regionen zeigten, dass ein Mangel an Lcn2 protektiv gegen die lokale Apoptose wirkt verglichen mit den WT-Mäusen. Auf der Suche nach dem zugrunde liegenden Mechanismus der gesteigerten Entzündungsreaktion bei Fehlen von Lcn2 zeigte sich, dass Lcn2 einen direkten pro-apoptotischen Effekt auf murine pulmonale Epithelellen in vitro ausübte. Inkubation von LA-4 Zellen mit rekombinantem Lcn2 und Vergleiche mit TUNEL-Färbungen unbehandelter Kontrollen zeigten, dass eine Inkubation mit Lcn2 signifikant Apoptose in LA-4 Zellen induzierte. Es konnte ferner gezeigt werden, dass Lcn2 in murinen Epithelzellen dosisabhängig durch verschiedene pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1ß, TNF-α und in geringem Maße durch das Th2 Zytokin IL-4 und das Th1 Zytokin IL-12 hoch reguliert wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass Lcn2 ein neuartiger Kandidat für ein Signalgen zur Identifizierung der AI sein könnte, ungeachtet des genetischen Hintergrundes dieser Krankheit.Allergic bronchial asthma (AB) has become the most commonly chronic airway disease . Despite all proceedings in therapy of AB the total rate of mortality has easiliy been grown up during the last decades due to the strong increament of incidence and prevalence of AB. The goal of this study was to make a contribution to increase the understanding of the pathomechanismen of AB thus to the functional analysis of new genes in a mouse model. Over 300 differentially relevant regulated new genes were identified through microarray analysis and a choice of genes were validated through qPCR which are involved in the formation of airway inflammation (AI) and airway hyperresponsiveness (AHR). As a result of microarray analyses 27 different genes could be found which were 2 x fold consistently upregulated after allergic (OVA) sensitization and challenge and this in two different mouse strains (BALB/c und C57BL/6). Among these genes genes were found which have to be linked with inflammatory processes e.g. GPX2, Arg1, Saa3, Mmp12 and Lcn2. For instance of Lipocalin (Lcn2) the funtional relevance of gene expression was verified. These results are the main focus of this study. Western-blot analyses of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) directly confirmed the biological relevance of the increased mRNA expression through the confirmation and enhanced translation and production of the secreted protein Lipocalin-2. In the mouse model of allergic inflammation and AHR the influence of Lcn2-expression at the characteristic feature of this disease pattern of AB was analysed with wildtype and Lcn2-deficient mice (KO). Genetical Lcn2-deficiency resulted in a significant increased development of the phenotype of acute airway inflammation (AI) in the mouse model. Compared with WT-littermates Lcn2 KO-mice showed an increased influx of eosinophilic granulocytes and lymphocytes after allergic sensitization and challenge. In contrast to this the allergic sensitization was not involved, the production of total and OVA-specific IgE was equal in both WT and KO-mice. Comparing airway resistance as a functional parameter in isolated perfused and ventilated lungs of sensitized and challenged Lcn2 KO- and wild type mice, it showed significantly higher resistances in Lcn2 KO-mice than in the corresponding WT controls. Simultaneously it appeared that in histological samples the genetical Lcn2-deficiency in KO-mice resulted in significant lower pulmonary apoptosis in vivo. In the model of acute AI significantly higher amounts of TUNEL+ positive cells were found in WT-mice than in Lcn2 KO-mice. Analyses of TUNEL+ positive regions indicated that a lack of Lcn2 acts protective against the local apoptosis in comparison to WT-mice. In search of the responsible mechanismen of the increasing inflammation due to the lack of Lcn2 a direct pro-apoptotic effect of pulmonary epithelial cells was indicated in vitro. Incubation of LA-4 cells with recombinant Lcn2 in comparisons of TUNEL-stainings with untreated controls indicated that an incubation with Lcn2 induced significant apoptosis in LA-4 cells. Further analyses showed that Lcn2 was upregulated in murine epithelial cells through different pro-inflammatory cytokines in a dose dependent manner e.g. IL-1ß, TNF-α and in a minor degree through the Th2 cytokine IL-4 and the Th1 cytokine IL-12. These data indicate that Lcn2 might be a novel candidate for a signaling gene for identifying AI regardless of the genetic background of this disease