Identification and characterisation of new tumor-associated T-cell epitopes for immunotherapy

Titelblatt u. Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Krebs 1 1.1.1 Das maligne Melanom 1 1.1.2 Krebs und Polyomaviren 2 1.2 Das Immunsystem 3 1.2.1 Der T-Zellrezeptor und seine Diversität 4 1.2.2 Effektormechanismen zytotoxischer CD8+ T-Zellen 6 1.2.3 Der Haupthistokompatibilitätskomplex 8 1.2.4 Peptidbindungseigenschaften von HLA-Molekülen 9 1.2.5 Antigenprozessierung durch das Proteasom und Aminopeptidasen 12 1.2.6 Peptidbeladung von HLA-Klasse I Molekülen 13 1.3 Tumorimmunologie 14 1.3.1 Tumorantigene 15 1.3.2 Identifizierung von TAA und tumorassoziierten T-Zellepitopen (TATE) 16 1.4 Bioinformatik 17 1.5 Immuntherapie 19 1.6 Zielsetzung 21 2 Material und Methoden 22 2.1 Standardmedien und puffer 22 2.1.1 Medien: 22 2.1.2 Puffer: 22 2.2 Oligonukleotidprimer 22 2.3 Bioinformatik 25 2.4 Auswahl von Peptiden aus BKV und JCV 25 2.5 Auswahl von Peptiden aus der MAGE-A Familie 26 2.6 Peptide 26 2.7 Zellbiologische Methoden 26 2.7.1 Isolierung von PBMC aus Vollblut 26 2.7.2 Bestimmung der Lebendzellzahl 27 2.7.3 Kryokonservierung 27 2.7.4 Anreicherung von CD8+-T-Zellen aus PBMC 27 2.7.5 FACS-Analyse 28 2.7.6 In vitro priming von CD8+ T-Zellen gesunder Spender mit 1970 Peptiden 28 2.7.7 In vitro priming von CD8+ T-Zellen gesunder Spender mit Peptiden aus SV40, BKV und JCV 30 2.7.8 Restimulation der CD8+ T-Zellen 30 2.7.9 ELISpot 30 2.7.10 51Chrom-Freisetzungsassay 32 2.7.11 Stabilisierungsassay 32 2.7.12 Behandlung von PBMC mit 5´Aza-2´Desoxycytidin (5-Aza-dC) 33 2.8 Molekularbiologische Methoden 33 2.8.1 RNA-Extraktion. 33 2.8.2 Reverse Transkription von RNA in cDNA 33 2.8.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) zur Expressionsanalyse 34 2.8.4 Gelelektrophorese 34 2.8.5 Gelextraktion 35 2.8.6 Sequenzierung von PCR-Produkten 35 3 Ergebnisse 36 3.1 Identifizierung nicht-kanonischer T-Zellepitope mit Hilfe artifizieller neuronaler Netze 36 3.1.1 Vorhersage der verwendeten Peptide 36 3.1.2 Vergleich der Vorhersagen der ANN mit SYFPEITHI und BIMAS 37 3.1.3 HLA-Stabilisierung durch die natürlichen Peptide und ihre modifizierten Varianten 38 3.1.4 T-Zellantworten gegen die vorhergesagten Peptide und ihre modifizierten Varianten 40 3.1.5 Vergleich der T-Zellantworten gegen die natürlichen und modifizierten Varianten der vohergesagten Epitope 43 3.1.6 Prozessierung und Präsentation der natürlichen Peptide durch Melanomzellen 46 3.2 Identifizierung von T-Zellepitopen nach Vorhersagen mit SVM und PSSM 49 3.2.1 Auswahl der Antigene 49 3.2.2 Bioinformatische Vorhersagen 49 3.2.3 Durchführung der Stimulationen und des ELISpots 51 3.2.4 T-Zellantworten nach in vitro priming gesunder Spender 53 3.2.5 HLA-Restriktion der Peptide Sur80 und Tyro345 59 3.2.6 Ex vivo Reaktionen von spezifischen CD8+ T-Zellen aus Melanompatienten und gesunden Spendern 60 3.3 Identifizierung von T-Zellepitopen aus SV40, BKV und JCV 66 3.3.1 In vitro priming von CD8+ T-Zellen gesunder Spender 67 3.3.2 Ex vivo Reaktionen von spezifischen T-Zellen aus Melanompatienten und gesunden Spendern 71 3.4 Expression tumorassoziierter Antigene im Melanom und anderen Geweben 74 3.5 Analyse zur Expression der MAGE-A Familie der cancer/testis Antigene 77 3.5.1 Organisation des MAGE-A Clusters auf Xq28 77 3.5.2 Das MAGE-A Subcluster III ist hoch repetitiv und invertiert dupliziert 77 3.5.3 Expression von MAGE-A mRNA im Melanom 79 3.5.4 Korrelation des Expressionsmusters und der chromosomalen Lokalisation 82 3.5.5 Induktion der MAGE-A und CSAG Expression 83 3.5.6 mRNA Expressionsmuster der MAGE-As und CSAGs in nicht melanozytären Tumoren und gesunden Kontrollen 84 3.6 Ex vivo Reaktionen von spezifischen T-Zellen gegen Peptide der MAGE-A Familie 86 3.7 Theoretische Analyse zur natürlichen Prozessierung der identifizierten Epitope 90 4 Diskussion 94 4.1 Schlußfolgerung und Ausblick: 114 5 Zusammenfassung 116 6 Summary 117 7 Literaturverzeichnis 118 8 Anhang 131 8.1 Anhang I: Bindungsmotive verschiedener HLA-Allele 131 8.2 Anhang II: Nach Vorhersage mit SVM und PSSM ausgewählte Peptide 133 8.3 Anhang III: Ausgewählte Peptide aus JCV und BKV 154 8.4 Anhang IV: Tumorassoziierte Antigene aus denen Vorhersagen mit SVM und PSSM durchgeführt wurden 155 8.5 Anhang V: TAA Expression in einzelnen Proben 157 9 Eigene Publikationen 158 10 Danksagung 160 11 Curriculum Vitae 161In der hier vorgelegten Arbeit wurden neue Ansätze zur Identifizierung tumorassoziierter T-Zellepitope verfolgt. Zum einem wurde das Ergebnis artifizieller neuronaler Netze überprüft, mit denen Peptide vorhergesagt wurden die nicht den üblichen Bindungsmotiven für HLA-A*0201 entsprechen. Die 7 aus diesen Vorhersagen resultierenden Peptide wurden im Vergleich mit 7 Ankerposition-modifizierten Varianten in T-Zellassays getestet und zeigten sich alle potent im Induzieren von T-Zellantworten nach in vitro priming gesunder Spendern. Auch zeigten sich insgesamt gegen alle ex vivo T-Zellantworten in fünf untersuchten Melanompatienten. Für drei der Peptide konnte gezeigt werden, daß T-Zellen, die mit der modifizierten Peptidvariante induziert wurden auch in der Lage waren, mit dem natürlichen Peptid beladene HLA-A2 positive Zielzellen zu erkennen. Für diese drei Peptide konnte außerdem die natürliche Prozessierung durch Tumorzellen nachgewiesen werden. Zum anderen wurden über 2000 Peptide in einem völlig neuen Ansatz getestet. Erstmalig wurde eine solche Anzahl von Peptiden in einem Stimulationsansatz untersucht und auch die Testung der Peptide in vollkommen HLA-unabhängigen Ansätzen wurde so noch nicht durchgeführt. Durch die Durchführung der Versuche mit Spendern, die nicht nach ihrem HLA ausgesucht wurden konnten neue Erkenntnisse zu Bindungsmotiven von HLA-Molekülen und zur Verbessung der Algorithmen gewonnen werden. Faßt man die Ergebnisse aus allen Analysen dieser Arbeit zusammen, konnten insgesamt 122 neue potentielle T-Zellepitope für verschiedene HLA-Allele identifiziert werden. Außerdem wurde die Expression der für die Vorhersagen verwendeten Proteine mittels RT-PCR untersucht, hierbei konnte gezeigt werden, daß nur wenige der Antigen ausschließlich in Tumorgewebe exprimiert sind und daß auch Proteine wie LAGE, GAGE und NY-ESO, die eigentlich als cancer/testis Antigene beschrieben wurden, eine weitverbreitete Expression aufwiesen. Desweiteren konnte bei näherer Untersuchung der Expression der MAGE-A Familie der cancer/testis Antigene, deren Expression nur im Melanom und in Zelllinien gefunden wurde, demonstriert werden, daß in jedem untersuchten Melanom mindestens ein Mitglied dieser Familie exprimiert wird. Die Gene aus dem invertiert duplizierten Subcluster III werden mit denen einer anderen CTA Familie, den CSAGs koexprimiert.In the work presented here, new approaches for the identification of tumor- associated T cell epitopes were employed. Using artificial neural networks 7 HLA-A*0201-restricted potential T cell epitopes, that do not conform to the canonical anchor motif for this HLA molecule, were predicted and tested in comparison with 7 anchor-position modified variants of these peptides. All of these peptides were able to induce T cell responses after in vitro priming of T cells from healthy donors. In five melanoma patients ex vivo T cell responses to all of these peptides were detected. For three of the peptides it was shown that T cells induced with the modified version of the peptide responded to the natural counterpart as well when loaded on HLA-A2 positive target cells. For these three epitopes it was also confirmed that they were naturally processed and presented by tumor cells. In addition more than 2000 peptides were tested using a new approach. For the first time such a high number of peptides were assayed using a stimulation method where the analysis was totally independent from the expressed HLA. By doing so, new insights in the binding motifs of HLA molecules could be obtained and used to improve the algorithms. Taken together the results of all the analyses performed in this work, a total of 122 new T cell epitopes matching different HLA alleles could be identified. Furthermore, the expression pattern of the proteins used for epitope prediction were analyzed using RT-PCR. It was demonstrated that only a few of these antigens are expressed exclusively by tumor cells. Also proteins described as cancer/testis antigens LAGE, GAGE and NY-ESO showed a widespread expression in the analysed samples. In addition, detailed examination of the expression of the MAGE-A family of cancer/testis antigens showed that these antigens are expressed solely by melanomas and different cell lines. At least one member of this family was expressed by every melanoma sample analysed. It could be shown that the genes of the inverted duplicated MAGE subcluster III are coevally expressed with another family of CTA, the CSAGs