The transfer proteins TraG and TrbB of the conjugative plasmid RP4: structural and functional similarities to analogous components of other transport systems

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1.EINLEITUNG 1 1.1 Bakterielle Konjugation 1 1.2 Das promiskuitive IncPa-Plasmid RP4 2 1.3 Der konjugative DNA-Transfer des Plasmides RP4 4 1.3.1 Die Rolle von TraG-ähnlichen Proteinen in der Konjugation 7 1.3.2 TrbB ist Mitglied der PulE-Superfamilie 9 1.4 Aufgabenstellung 12 2\. MATERIALIEN 15 2.1 Plasmide 15 2.2 Bakterienstämme 17 2.3 Bakteriophagen 17 2.4 Medien 17 2.5 Chemikalien, Proteine und Nukleinsäuren 18 2.6 Puffer 19 2.7 Sonstige Materialien 20 3.METHODEN 21 3.1 DNA-Techniken 21 3.1.1 Isolierung von DNA 21 3.1.2 Allgemeine in vitro-Rekombinationstechniken 21 3.1.3 Herstellung einer trbB-in frame-Deletionsmutante 22 3.1.4 Erzeugung von trbB-Punktmutationen 23 3.1.5 DNA-Sequenzierung 23 3.1.6 Herstellung von 32P-markierten ds-DNA-Fragmenten 23 3.2 Konjugation 24 3.3 Elektrophoresetechniken 24 3.3.1 Elektrophoresetechniken zur Auftrennung von DNA 24 3.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 25 3.4 Proteinanalyse 25 3.4.1 Proteinüberproduktion durch induzierte Genexpression 25 3.4.2 Denaturierender analytischer Zellaufschluß 26 3.4.3 Nativer analytischer Zellaufschluß 26 3.4.4 Proteinreinigung 26 3.4.5 Quantitative Proteinbestimmung 27 3.4.6 Transfer von Proteinen auf eine Trägermembran 27 3.4.7 Immunologischer Nachweis von Proteinen (SOPHIA) 27 3.4.8 Protein-Sequenzierung 28 3.5 Elektronenmikroskopie 28 3.6 Glyceringradientenzentrifugation 28 3.7 Bestimmung der NTPase-Aktivität 28 3.8 Fragmentretentionstest zur Analyse von DNA-Protein-Komplexen 29 3.9 Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen 29 4.ERGEBNISSE 31 Teil 1 Die TraG-ähnlichen Proteine interagieren mit Komponenten des Relaxosoms 4.1 Ein Sequenzvergleich der TraG-ähnlichen Proteine legt die Unter-teilung in zwei Unterfamilien nahe 31 4.2 RP4 TraG und F TraD ließen sich nach Modifizierung reinigen 33 4.2.1 Die N-terminale Modifizierung von RP4 TraG und F TraD beeinträchtigte nicht die Transferfunktion der Proteine 33 4.2.2 Affinitätschromatographie mit Ni-NTA ergab gereinigtes His6-TraG und His6-TraD 35 4.3 His6-TraG und His6-TraD besitzen keine ATPase-Aktivität 37 4.4 His6-TraG und His6-TraD binden nicht-sequenzspezifisch an dsDNA und ssDNA 40 4.5 His6-TraG bindet an die Relaxase von RP4 und His6-TraD an R1 TraM 43 Teil 2 RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 von Helicobacter pylori besitzen strukturelle und enzymatische Gemeinsamkeiten 4.6 TrbB ist eine für die Konjugation von RP4 essentielle, enzymatische Komponente des Mpf-Komplexes 47 4.6.1 Die Gene trbB und trbC sind translational gekoppelt 48 4.7 Die Reinigung von RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 erfolgte unter nativen Bedingungen 49 4.7.1 Die Überexpression von RP4 trbB, R388 trwD und cag HP0525 in E. coli führte zur Überproduktion von löslichem Protein, das in vivo aktiv war 49 4.7.2 Eine dreistufige Reinigung führte zu nahezu homogenen RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 51 4.8 RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 sind NTP-Hydrolasen 53 4.8.1 dATP, GTP und ATP sind Substrate für RP4 TrbB 53 4.8.2 Die NTPase-Aktivität von RP4 TrbB besitzt zwei pH-Maxima 54 4.8.3 Das Substratspektrum der NTPase-Aktivität von RP4 TrbB und R388 TrwD unterscheidet sich vom cag HP0525-Substratpektrum 54 4.9 RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 besitzen eine ähnliche hexamere Ringstruktur 55 4.9.1 Physikalische Eigenschaften von RP4 TrbB und cag HP0525 55 4.9.2 RP4 TrbB und cag HP0525 bilden Hexamere 57 4.9.3 Die oligomeren Strukturen von RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 sind ringförmig 57 4.9.4 Die Hexamere von RP4 TrbB und cag HP0525 bestehen aus unregelmäßig trigonalen Untereinheiten 58 4.10 trbB-Mutationsanalyse von innerhalb der PulE-Superfamilie konservierten Bereichen 60 4.10.1 Die intakte Typ A-NBS in TrbB ist für den konjugativen Transfer von RP4 essentiell 61 4.10.2 Eigenschaften der TrbB-Mutantenproteine 61 5.DISKUSSION 65 5.1 Die TraG-ähnlichen Proteine bilden eine neue Proteinklasse, deren Funktion auf die Konjugation beschränkt zu sein scheint 65 5.2 Die Rolle der Proteine der PulE-Superfamilie innerhalb der Assemblierung des Membrankomplexes 70 6.LITERATURVERZEICHNIS 75An der bakteriellen Konjugation sind zwei Multiproteinkomplexe beteiligt: (i) Das Mpf-System assembliert den Sex-Pilus und etabliert den Zell-Zell-Kontakt zum Rezipienten. (ii) Das Relaxosom katalysiert den DNA-Einzelstrangbruch an der nic-site des oriT. Die TraG-ähnlichen Proteine sind für die Konjugation essentiell, können bisher jedoch weder dem Mpf-System noch dem Relaxosom zugeordnet werden. TraG-ähnliche Proteine bilden eine neuartige Proteinklasse, deren Funktion auf die Konjugation beschränkt zu sein scheint. Die modifizierten Vertreter RP4 His6-TraG und F His6-TraD banden nicht- sequenzspezifisch an dsDNA und ssDNA, wobei ssDNA das bevorzugte Substrat war. His6-TraD bildete einen Komplex mit R1 TraM, einem möglichen Bestandteil des Relaxosoms. His6-TraG interagierte ebenso wie His6-TraD mit der Relaxase von RP4. Dies zeigt, daß die TraG-ähnlichen Proteine mit Komponenten des Relaxosoms wechselwirken. Da His6-TraG und His6-TraD keine NTPase-Aktivität besaßen, scheinen sie keinen energieverbrauchenden Prozeß zu katalysieren. Deshalb lassen sich für die TraG-ähnlichen Proteine zwei mögliche Funktionen innerhalb der Konjugation ableiten. Entweder initiieren sie das Ablösen des zu transferierenden DNA-Einzelstranges von der Plasmid-DNA oder führen ihn der Transportpore zu. Eine direkte Beteiligung am DNA-Transport ist denkbar, wenn eine Kopplung an ein NTP-spaltendes Enzym vorliegt. Im RP4-System könnte dies TrbB oder TrbE sein. Ein His6-TraG-TrbB-Komplex konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Vertreter der PulE-Superfamilie sind eine essentielle Komponente eines membrandurch-spannenden Multiproteinkomplexes (wie z.B. des Mpf-Komplexes), der an so unterschied-lichen Vorgängen wie der Ausscheidung von Proteinen (z.B. Toxinen), der Pilus-assemblierung, dem twitching motility und der Aufnahme von DNA mittels natürlicher Transformation beteiligt ist. Die gereinigten PulE-ähnlichen Proteine RP4 TrbB und cag HP0525 von Helicobacter pylori bildeten eine hexamere Ringstruktur aus, die zwei chemisch unterscheidbare Seiten besaß. Lokalisierungsstudien lassen vermuten, daß die eine Seite mit der inneren Membran assoziiert ist und die andere in das Cytoplasma ragt. Die strukturellen Eigenschaften von TrbB wurden auch für Chaperone der Hsp100-Familie beschrieben. Das gereinigte PulE-ähnliche Protein R388 TrwD bildete ebenfalls Ringstrukturen aus, deren nähere Architektur aber noch nicht geklärt wurde. Zusätzlich wurden bei TrwD stäbchen-förmige Strukturen beobachtet. Nukleotide stabilisierten die Ringe von TrbB und TrwD. TrbB, TrwD und HP0525 besaßen NTPase-Aktivität, die in der gleichen Größenordnung wie die der Chaperone lag. Mutationsstudien mit TrbB zeigten, daß diese Aktivität von TrbB für die Konjugation notwendig ist. Die strukturellen und enzymatischen Gemeinsamkeiten von TrbB, TrwD, HP0525 und Chaperonen, lassen vermuten, daß PulE-ähnliche Proteine durch Fixierung von Komponenten des Membrankomplexes in einer bestimmten Konformation die Assemblierung des Komplexes unterstützen. Dies könnte den Transport der Komponenten über die innere Membran und/oder das Binden an einen weiteren (Mpf)-Bestandteil ermöglichen.Two protein complexes are involved in bacterial conjugation: (i) The Mpf system is required for the assembly of the sex-pilus and establishes the physical contact between the donor and recipient cell. (ii) The relaxosome is responsible for the specific cleavage at the origin of transfer. TraG-like proteins are essential for conjugation. However, they are belonging neither to the Mpf-system nor to the relaxosome. TraG-like proteins form a novel protein class probably specific to conjugation. The modified representatives His6-TraG and His6-TraD were shown to bind DNA non-specifically with ssDNA as the apparently preferred substrate. His6-TraD formed a complex with R1 TraM which is thought to be a component of the relaxosome. His6-TraG and His6-TraD were shown to interact with the relaxase of RP4. All these results indicate that the TraG-like proteins interact with components of the relaxosome. Neither His6-TraG nor His6-TraD possessed a NTPase activity, suggesting that they are apperantly not involved in an energy consuming process. Thus two possible functions for TraG-like proteins can be suggested. Either they might initiate the generation of the single plasmid strand destined to be transferred or they connect it to the pore through which the DNA is transferred. A direct involvement of the TraG-like proteins in the DNA transfer is possible when they are coupled to a NTPase like TrbB or TrbE of the RP4 system. However, a His6-TraG-TrbB complex was not formed. Representatives of the PulE-superfamily are an essential part of a membrane-spanning complex (like the Mpf system) involved in a wide variety of processes such as protein secretion, pilus assembly, twitching motility and DNA uptake via natural transformation. The purified PulE-like proteins RP4 TrbB and cag HP0525 of Helicobacter pylori formed hexameric ring-shaped complexes. The defined handedness of the TrbB6 and HP05256 images demonstrated that the hexameric rings have two sides with different chemical properties. Due to localisation experiments it may be assumed that these hexameric proteins face the hydrophilic cytoplasm on one and the hydrophobic membrane on the other side. Structural features of TrbB were also reported for chaperones of the Hsp 100 family. Purified R388 TrwD, which is another representative of the PulE-superfamiliy, also formed ring- shaped structures which appeared to be similar to TrbB6 and HP05256. Additionally TrwD tended to form tube-like aggregates. Nucleotides were shown to stabilise the ring-structure of TrbB and TrwD. TrbB, TrwD and HP0525 possess a NTPase-activity in an order of magnitude similar to chaperons. Analyses of TrbB mutants showed that the NTPase activity is essential for its function in vivo. According to structural and enzymatic similarities of TrbB, TrwD, HP0525, and chaperons, PulE-like proteins might aid the assembly of the membrane-spanning complex by binding to its components. Thus these components might be translocated across the inner membrane and/or able to bind to further components to form the entire membrane-spanning complex