Impact of prolonged cold ischemia on transplantation tolerance

Die Nierentransplantation stellt heute für Patienten mit terminalem Nierenversagen die Therapie der Wahl dar. Mit der Notwendigkeit zur lebenslangen Immunsuppression gehen jedoch erhebliche Risiken, Kosten und Verpflichtungen einher. Als eine optimale Lösung für dieses Dilemma gilt die Induktion von transplantatspezifischer Toleranz. Von vielen möglichen Ansätzen stellt die Induktion von sogenannter Infektiöser Toleranz mit Hilfe von monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern ein einfaches und robustes Verfahren dar. Die Dauer der Kaltischämiezeit ist klinisch mit einer verkürzten Überlebenszeit des Transplantats assoziiert. Der vorgelegten Arbeit liegt die Frage zugrunde, welchen Einfluss eine verlängerte Kaltischämiezeit auf die Transplantatfunktion ausübt, wenn ein Regime zur experimentellen Induktion von Infektiöser Transplantattoleranz verwendet wird. Zudem wurde untersucht, wie die verlängerte Kaltischämiezeit die Fähigkeit der Immunzellen beeinflusst, die Immunantwort zu modulieren. Dazu wurden unter Therapie mit dem monoklonalen Anti-CD4-Antikörper RIB 5/2 in einem etablierten Rattenmodell Nierentransplantationen mit variierter Kaltischämiezeit durchgeführt. Die Transplantatfunktion wurde 100 Tage lang überwacht und die Organe wurden nach Ende des Beobachtungszeitraumes morphologisch auf Zeichen der chronischen Schädigung untersucht. Nach adoptivem Zelltransfer von Splenozyten aus der ersten Empfängergeneration erfolgte eine zweite Transplantationsserie. Diese Transplantate wurden 20 Tage nach Transplantation morphologisch auf Zeichen akuter Abstoßung untersucht. Mittels FACS (T-Zellen, Dendritische Zellen, donorstämmige Zellen), ELISA (IFNγ, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10) und ELISpot (Alloreaktivität von T-Zellen) wurden zudem relevante Parameter des Immunsystems der Empfänger untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Toleranzinduktion mit Hilfe des verwendeten Antikörpers trotz verlängerter Kaltischämie gelingt und zwar ohne signifikanten Einfluss auf die Transplantatfunktion und -morphologie. Dies stand im Gegensatz zu vergleichbaren Experimenten mit Ciclosporin A, in denen bereits nach 2 Stunden Kaltischämiezeit eine signifikante Verschlechterung der Transplantatfunktion und -morphologie nachgewiesen wurde. Die Analyse relevanter Zytokine und Zellpopulationen nach adoptivem Zelltransfer und Zweittransplantation zeigte eine verminderte Alloreaktion bei jenen Tieren, die Splenozyten aus der Gruppe mit verlängerter Kaltischämie erhalten hatten. Hier waren die antigenspezifische IFNγ-Produktion, sowie die IFNγ- und TNFα-Spiegel vermindert. In diesen Tieren fanden sich zudem signifikant niedrigere Anteile aktivierter (CD86+) Dendritischer Zellen und aktivierter spenderstämmiger Dendritischer Zellen. Einen zahlenmäßig größeren Einfluss hatten jedoch die spenderstämmigen Zellen insgesamt, die in dieser Gruppe ebenfalls signifikant vermindert waren. Die verminderte Alloreaktion in der 6h II Gruppe konnte darauf zurückgeführt werden, dass die Lymphozyten aus der Versuchsgruppe mit verlängerter Kaltischämiezeit besser in der Lage waren, die Abstoßungsreaktion auf das Transplantat zu unterdrücken. Ein klarer Zusammenhang zwischen der Konzentration der Zytokine IL-4, IL-6 und IL-10 und dem Ausmaß der Alloreaktion konnte nicht nachgewiesen werden.BACKGROUND: The introduction of potent immunosuppressives yielded a dramatic improvement in early organ graft survival. However, late graft loss caused by chronic allograft nephropathy (CAN) remains a major concern. Transplantation tolerance is regarded as the ultimate solution for this dilemma. Up to now, research has focussed on the underlying mechanisms and strategies of tolerance induction. The impact of classical risk factors for graft survival on transplantation tolerance induction remains unclear. With my doctoral thesis, I examined whether a prolonged cold ischemia time - known as a major risk factor for transplant outcome - has an impact on tolerance induction in an established rat model. METHODS: Based on an established protocol using a non- depleting anti-CD4 monoclonal antibody (RIB 5/2), tolerance was induced in a kidney transplantation rat model of strong histoincompatibility (DA to LEW). Kidney transplantation was performed either after 5 minutes or 6 hours of cold ischemia. To monitor graft function, creatinine clearance and proteinuria were measured serially until harvesting after 100 days. The degree of CAN was assessed histologically, based on the Banff Classification of Renal Allograft Rejection. To examine the effect of prolonged ischemia during tolerance induction on the ability of the regulatory lymphocytes, additional adoptive transfer experiments were performed. Splenocytes were isolated and injected into sublethally total body irradiated native LEW recipients prior to a second series of kidney transplantations. During these transplantations, no immunosuppression was used and the ischemia time was comparable for all grafts. After 20 days, the degree of acute rejection was assessed histologically. The immune cell and cytokine configuration in each compartment of kidney grafts, blood, spleens and lymph nodes were examined using ELISPOT (T-cell alloreactivity), ELISA (cytokine pattern) and FACS (T/B cells, dendritic cells). RESULTS: The monitoring of graft function could not reveal a significant difference between both groups after tolerance induction. The immune status 20 days after splenocyte transfer differed between both groups. Significantly lower levels of IFNγ were found in the group that had received lymphocytes from the group with prolonged ischemia. This finding was associated with significantly lower levels of donor-specific activated dendritic cells as well as donor-derived cells. CONCLUSIONS: Cold ischemia of 6 hours did not hamper the induction of tolerance using a protocol modifying signal 1 and no significant impact on graft function and morphology could be detected. This is of interest as others have previously demonstrated in a rat model of chronic rejection that cold ischemia of 2 hours has a significant impact on graft morphology and function if ciclosporin A is used. Following lymphocyte transfer, the immune response was less pronounced in the animals that received cells which had experienced prolonged cold ischemia during the antibody treatment. It can be concluded that these cells were better able to suppress the immune response