Allosteric Properties and Ligand Binding Domains of the Nicotinic Acetylcholine Receptor

0. Titelblatt 0 1. Einführung 7 1.1. Der nAChR als Schlüsselmolekül der synaptischen Signaltransduktion 7 1.2. Der nAChR als allosterisches Protein 8 1.2.1. Das Prinzip der Allosterie 8 1.2.2. Die oligomere Struktur des nAChR 10 1.2.3 Die Bindungsstellen für Agonisten und kompetitive Antagonisten liegen an den Kontaktflächen zwischen benachbarten Untereinheiten 12 1.2.4. Der Ionenkanal des nAChR liegt auf der zentralen Pseudo-Symmetrieachse und wird durch allosterische Mechanismen geöffnet 16 1.2.5. Der nAChR kann verschiedene funktionelle Zustände einnehmen 19 1.2.6. Weitere allosterische Bindungsstellen 20 2. Aufgabenstellung und experimenteller Ansatz 24 3. Ergebnisse 25 3.1. Das Gleichgewicht zwischen den allosterischen Zuständen des nAChR 25 3.1.1. Durch kovalente Vernetzung können die allosterischen Eigenschaften des nAChR unterbunden werden 25 3.1.2. Ausschließlich Agonisten können den nAChR vom Ruhe- in den desensibilisierten Zustand überführen 27 3.1.3. Affinitäten verschiedener Liganden für die beiden Zustände 30 3.2. Die Bindungsstellen für nicht-kompetitive Inhibitoren des nAChR 38 3.2.1. Lokalisierung der Bindungsstelle für Ethidium im Kanallumen 38 3.2.2. Überlappung der Bindungsstellen für Quinacrin und Ethidium 42 3.2.3. Bindungseigenschaften von Polyaminderivaten 45 3.3. Einfluss der Membran auf das Bindungsverhalten von kompetitiven Antagonisten und Agonisten 54 3.3.1. Die Bindungskapazität für alpha-BgTx korreliert mit der Packungsdichte und der Membranfluidität nativer nAChR-reicher Membranen 55 3.3.2. Die Rolle der Lipidumgebung für Agonist-induzierte Konformationsübergänge 67 4. Diskussion 64 4.1. Das Symmetriemodell vermag die Bindungseigenschaften definierter allosterischer Zustände des nAChR nicht korrekt zu beschreiben 64 4.2. Die Konformationen des nAChR nach Vernetzung in Gegenwart verschiedener Liganden 67 4.3. Strukturveränderungen im Rahmen allosterischer Übergänge 69 4.4. Der Phänotyp von Mutanten im Bereich des Ionenkanals 71 4.5. Die Bindungsstellen für nicht-kompetitive Antagonisten 73 4.6. Einfluss der Membranfluidität auf die Bindung von alpha-Neurotoxinen an den nAChR 85 4.7. Einfluss von Cholesterin auf die Bindung von Acetylcholin 90 5. Zusammenfassung / Summary 91 6. Methoden 95 7. Literaturverzeichnis 113 8. Anhang 131 8.1. Abkürzungen und Einheiten 131 8.2. Eigene Veröffentlichungen 134 8.3. Tabellarischer Lebenslauf 136 8.4. Danksagungen 137Kürzlich ist gezeigt worden, dass der nikotinische Acetylcholinrezeptor (nAChR) durch chemische Vernetzung mit Glutardialdahyd in definierten Konformationen fixiert werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Konformationen, die dem Ruhe- bzw. dem desensibilisierten Zuständen ähneln, bezüglich ihrer Affinität für verschiedene Klassen von Liganden untersucht. Die gleichen Liganden wurden danach auf ihre Fähigkeit hin überprüft, den nAChR vom Ruhezustand in den desensibilisierten Zustand zu überführen. Erwartungsgemäß banden Agonisten mit höherer Affinität an den desensibilisierten Zustand und induzierten einen Übergang des nAChR in diese Konformation. Im Gegensatz dazu vermochten Antagonisten keine Veränderung des Affinitätszustands des nAChR auszulösen, obwohl die meisten von ihnen ebenfalls fester an den desensibiliserten Rezeptor banden. Diese Beobachtungen widersprechen eindeutig dem Symmetriemodell, das die Existenz eines präformierten Gleichgewichts zwischen allen allosterischen Zuständen auch in Abwesenheit von Agonist postuliert. Mit einem ähnlichen Ansatz wurde gezeigt, dass der nicht kompetitive Inhibitor Ethidium durch gut charakterisierte Kanalblocker auf nicht-allosterische Weise vom nAChR verdrängt wird. Folglich liegt die Bindungsstelle für Ethidium im Lumen des Ionenkanals und nicht ý wie früher postuliert ý in der extrazellulären Domäne des nAChR. Durch Fluoreszenztitrationen wurde nachgewiesen, dass die Bindungsstellen für Polyaminamide mit dem Ethidiumlocus überlappen. Die so ermittelten Affinitäten einer Serie von neu entwickelten Polyaminamid-Derivaten legen nahe, dass die Einführung hydrophober Element in die Struktur dieser Liganden die Bindung an den nAChR verstärkt. Der dritte Teil dieser Studie befasst sich mit dem Einfluss der Membran auf die Bindung von Agonisten und kompetitiven Peptidantagonisten. Bindungstests mit alpha-Bungarotoxin (alpha-BgTx) zeigten, dass nach Erhöhung der Temperatur oder nach Zugabe eines nicht-denaturierenden Detergens die Zahl mehr Bindungsstellen für alpha-BgTx zugänglich sind. Dies impliziert, dass sich alpha-Neurotoxine ihren Bindungsstellen von der Peripherie der extrazellulären Domäne des nAChR aus und nicht durch das Vestibül des Ionenkanals nähern. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Kooperativität der Acetylcholinbindung in starkem Maße von der Anwesenheit von Cholesterin in der Membran abhängt.Recent work has shown that the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) can be fixed in distinct conformations by chemical cross-linking with glutardialdehyde. Here, two conformations that resemble the desensitized and the resting states are compared with respect to their affinities for different classes of ligands. The same ligands are tested for their ability to convert the nAChR from the low-affinity resting state to the high-affinity desensitized state. As expected, agonists are found to bind with higher affinity to the desensitized state and to induce a shift of the nAChR to this conformation. In contrast, although most antagonists bind preferentially to the desensitized receptor as well they fail to induce a change of the affinity of the nAChR for acetylcholine. These observations sharply contradict basic predictions of the symmetry model including the postulate of a pre-formed equilibrium between the different states of the nAChR in absence of agonist. With a similar approach we show that the non-competitive inhibitor ethidium is displaced in a non-allosteric manner by well-characterized channel blockers from the cross-linked nAChR. Therefore, the ethidium locus must be located in the lumen of the nAChR´s ion channel and not within the extracellular domain as proposed earlier. Using ethidium as a reporter fluorophor in titration assays it is demonstrated that the binding sites for polyamine amides overlap with the ethidium locus. By testing a series of newly developed polyamine amide derivatives for their ability to bind to the receptor´s vestibule we show that the affinity of these compounds is strongly influenced by hydrophobic elements in their structure. The third part of this study focuses on the influence of the surrounding membrane on the binding of agonists and competitive peptide antagonists. Binding assays with alpha-bungarotoxin (alpha-BgTx) reveal that more binding sites for alpha-bungarotoxin are accessible upon an increase of the temperatur or the addition a non-denaturing detergent. These results indicate, that alpha-neurotoxins approach their binding sites from the membrane-facing periphery of the receptor´s extracellular domain rather than through the channel mouth. Furthermore, it is demonstrated that the cooperativity of acetylcholine binding depends dramatically on the presence of cholesterol in the membrane