Expression and Regulation of Trefoil factor 3 in clinical and experimental Endometriosis

Endometriose ist eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankungen und betrifft im Durchschnitt jede zehnte Frau im reproduktiven Alter. Sie wird definiert als das Vorkommen von endometrialen Stroma- und Epithelzellen außerhalb der Gebärmutter. Bis heute ist die genaue Ursache und Pathophysiologie noch nicht gänzlich geklärt. Trefoil factor 3 (TFF3) ist ein Protein, welches für den Schutz und die Regeneration der gastrointestinalen Mukosa mitverantwortlich ist. TFF3 wird auch in anderen Schleimhautepithelien exprimiert, wie z. B. in der Brust oder dem Uterus. Pathologisch wird es bei inflammatorischen Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts sowie in verschiedenen Tumoren als heraufreguliert beschrieben. Bisher liegen keine Daten zu TFF3 in der Endometriose vor. Die in der Literatur beschriebenen anti-apoptotischen, pro- invasiven und pro-angiogenen Eigenschaften lassen eine Beteiligung an den pathophysiologischen Prozessen bei der Entstehung und Entwicklung von Endometriose vermuten. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Expression und Regulation von TFF3 in klinischer und experimenteller Endometriose untersucht und seine mögliche Beteiligung an der Pathogenese diskutiert. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels histologischer Methoden die TFF3-Expression in Epithelzellen des eutopen Endometriums sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene bestätigt werden. Erstmals wurde die Expression in endometriotischen Läsionen der Endometriose gezeigt. Bei der Untersuchung von Peritonealflüssigkeiten war die TFF3-Konzentration in Frauen mit Endometriose (n = 34) signifikant höher als in Frauen ohne der Erkrankung (n = 16). Die erhöhten TFF3-Level korrelierten mit weiteren, ebenso heraufregulierten Proteinen: CA125 – einem bekannten Tumor- und Endometriosemarker, IL-8 – einem pro-inflammatorischen und pro-angiogenen Zytokin, MMP-7 – einem am Gewebeumbau beteiligten proteolytischen Enzym sowie MCP-1 und G-CSF – zwei an der Rekrutierung von Leukozyten beteiligten Faktoren. Im Serum von Frauen mit Endometriose (n = 75) war keine Erhöhung der TFF3-Konzentrationen im Vergleich zu der Kontrolle (n = 42) messbar. Dafür zeigte sich eine signifikante zyklusabhängige Regulation der systemischen TFF3-Spiegel während des Menstruationszyklus. Die höchsten Werte wurden dabei in der proliferativen und in der späten sekretorischen Phase detektiert, während die niedrigsten TFF3-Konzentrationen am ersten Tag der Menstruation und drei Tage nach der Ovulation während der frühen sekretorischen Phase zu messen waren. Für weitere Untersuchungen wurde in einem In-vivo-Modell Endometriose durch syngene Transplantation von Uterusfragmenten an das Peritoneum von C57BL/6-Mäusen induziert. Immunhistologische Studien zeigten zu allen Sektionszeitpunkten (2, 4, 8 bzw. 14 Wochen) die Expression von TFF3 in den endometriotischen Läsionen und Uteri der Tiere. In den Peritoneallavagen waren die TFF3-Konzentrationen zu frühen Zeitpunkten (2 und 4 Wochen nach Transplantation) signifikant erhöht. Die heraufregulierten TFF3-Spiegel korrelierten mit Markern für systemische Inflammation wie Milzgewicht und Akute-Phase-Proteinen (SAP, SAA-3, Haptoglobin). In endometrialen ECC-1-Zellen konnte durch Stimulation mit 17β-Estradiol nach 2 h eine signifikant erhöhte Genexpression von TFF3 gemessen werden. Die Stimulation mit TNFα führte nach 24 h zu einer signifikanten Herunterregulation von TFF3-mRNA. Die Stimulation mit rekombinantem TFF3 führte in ECC-1-Zellen zu einer erniedrigten Expression von Adenomatous polyposis coli (APC), während die von E-Cadherin und den Cateninen unverändert blieb. Die TFF3-Stimulation führte zu einer verbesserten Zellviabilität während es bei Kostimulation mit TNFα dessen pro-apoptotische Wirkung signifikant verstärkte. Die vorliegende Arbeit liefert erstmalig Hinweise dafür, dass TFF3 an der Pathogenese der Endometriose beteiligt sein könnte. Nach der Transplantationstheorie von Sampson entsteht Endometriose durch retrograde Menstruation mit der Migration vitaler Endometriumszellen in den Bauchraum und ihrer Implantation in das Peritoneum. TFF3 weist eine Vielzahl von Eigenschaften auf, die die Migration, Invasion und Neoangiogenese von Endometriumszellen begünstigen könnten. Auch eine Beteiligung von TFF3 an der Immunmodulation durch Leukozytenrekrutierung ist denkbar. Die neugewonnen Erkenntnisse dieser Arbeit tragen insgesamt zum Verständnis pathophysiologischer Prozesse in der Endometriose bei und könnten für die Entwicklung zukünftiger Therapieansätze von Bedeutung sein.Endometriosis is a chronic gynecological disease, characterized by endometrial tissue outside the uterus. It affects 10 % of women during reproductive age. The pathogenesis and pathophysiology of this disease is still unsolved. Trefoil factor 3 (TFF3) is a peptide involved in the protection and regeneration of the small and large intestinal epithelia. In a smaller amount it is also expressed from a various amount of mucous epithelia, like in the breast or the uterus. It is pathologically elevated in a wide range of human carcinomas and gastrointestinal inflammatory conditions. Until today, nothing is known about the expression and regulation of TFF3 in endometriosis. Literature data describes anti-apoptotic, pro-invasive and pro-angiogenic effects of TFF3. Therefore, TFF3 might be involved in the pathogenesis and progression of endometriosis. The aim of this study was to examine whether TFF3 is expressed and regulated in clinical and experimental endometriosis and if it plays a role in the development of this disease. Using immunohistochemistry and in situ hybridization TFF3 was localized in glandular epithelia cells of eutopic endometrium. For the first time TFF3 expression in endometriotic lesions was shown. In peritoneal fluids of women with endometriosis TFF3 concentrations were significantly elevated and correlated with regulated factors, such as CA125, IL-8, MMP-7, MCP-1 and G-CSF. TFF3 serum levels showed no difference between endometriosis patients and controls but revealed a significant cycle dependency throughout the menstrual cycle of women with highest levels in proliferative and late secretory phase. In an experimental mouse model for endometriosis TFF3 expression was shown in endometriotic lesions and uteri using immunohistochemistry. TFF3 levels in peritoneal lavages of mice were significantly increased during early stages. Elevated TFF3 values correlated with systemic parameters for inflammation such as spleen size and acute phase proteins in serum. In endometrial ECC-1 cells TFF3 expression was upregulated by stimulation with estradiol and downregulated by TNFα. Incubation with recombinant TFF3 led to decreased expression of adenomatous poli catenin (APC), while the expression of E-cadherin and catenins remained unchanged. TFF3 improved cell viability, whereas in combination with TNFα it augmented apoptotic effects. This study indicates for the first time a potential role for TFF3 in the pathogenesis of endometriosis. Regarding transplantation theory, endometriosis is a result of retrograde menstruation including the migration of vital endometrial cells into the peritoneal cavity and their implantation at ectopic sites. Based on the expression and regulation in endometriosis shown in study, combined with its functions described in previous publications, TFF3 seems to be involved in migration, invasion and neoangiogenesis of endometrial cells as well as in immunomodulation. In conclusion, the findings of this study contribute to the understanding of pathophysiological processes in endometriosis and might be of relevance for the development of future therapeutic approaches