Generation of cytomegalovirus specific T-cell lines from healthy and immunocompromised donors for adoptive therapy

Titelblatt und Verzeichnisse Einleitung Ziele der Arbeit Methoden Ergebnisse Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungen Eidesstattliche ErklärungIn der Transplantation stellen Zytomegalovirus- (CMV-) Infektionen ein ernstzunehmendes Problem dar und können sowohl das Überleben des Patienten als auch das des Transplantats negativ beeinflussen. Zur Behandlung von CMV- Komplikationen ist die medikamentöse antivirale Therapie die erste therapeutische Option. Eine langfristige Behandlung durch antivirale Substanzen ist aber aufgrund toxischer Nebenwirkungen sowie viraler Resistenzbildungen nur bedingt möglich. Die einzige Möglichkeit einen langfristigen Schutz vor CMV-Komplikationen zu gewährleisten, ist die Etablierung einer effektiven CMV-spezifischen Immunantwort. Bei transplantierten Patienten ist die natürliche Entwicklung einer protektiven Antwort durch die medikamentöse Immunsuppression, welche die Abstoßung des transplantierten Organs verhindern soll, stark erschwert. Darum setzen neuere Therapieansätze auf den adoptiven Transfer in vitro-manipulierter CMV- spezifischer T-Zelllinien zur Überwindung dieses iatrogenen Effektes. Obwohl klinische Studien die Sicherheit und Effektivität adoptiv transferierter T-Zelllinien in der Bekämpfung von CMV-Komplikationen belegten, kommen diese bis heute lediglich bei wenigen Patienten zur Anwendung. Dies ist vor allem durch den technisch aufwendigen Herstellungsprozess, sowie die mangelnde Übertragbarkeit vieler Generierungsmethoden in die klinische Praxis bedingt. Kürzlich wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Protokoll entwickelt, das die Herstellung CMV-spezifischer T-Zelllinien aus gesunden Probanden ermöglicht. Dieses Protokoll basiert auf der Stimulation mit überlappenden Peptidpools, der anschließenden magnetischen Isolierung der Interferon-γ\- sezernierenden Zellen, sowie deren in vitro-Expansion. Dieses Protokoll überwindet viele Limitierungen bisheriger Herstellungsmethoden, da es für jeden HLA-Typ einsetzbar ist und keine Kenntnis von immundominanten Epitopen voraussetzt. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Weiterentwicklung und Verbesserung dieses Herstellungsprotokolls. Es konnte gezeigt werden, dass die beschriebene Methode für die Herstellung von CMV-spezifischen T-Zelllinien aus immunsupprimierten Patienten genutzt werden kann. Dadurch können Patienten nach solider Organstransplantation behandelt und somit die Anwendung der Methode um ein Vielfaches ausgeweitet werden. Des Weiteren wurden T-Zelllinien gegen mehrere virale Proteine aus demselben Spender generiert. Die dadurch erreichte breitere Antigenreaktivität sollte die Effizienz der adoptiven Immuntherapie weiter erhöhen. Abschließend wurde in dieser Arbeit die Übertragbarkeit der Generierungsmethode in die klinische Praxis demonstriert, und es konnte ein Patient mit CMV-spezifischen T-Zelllinien behandelt werden. Somit stellt das entwickelte Herstellungsprotokoll einen wichtigen Fortschritt in der adoptiven Immuntherapie dar und erlaubt eine bessere Versorgung von Patienten mit schweren CMV-Komplikationen. Des Weiteren ist zukünftig eine Übertragung dieser Methode auf die Behandlung anderer viraler Erkrankungen oder Tumoren denkbar.Transplant recipients are at increased risk for severe human cytomegalovirus (HCMV) infection, which impairs graft survival and increases patient mortality. Prolonged virostatic therapy is limited by its side effects and the development of viral resistance. Reconstitution of cellular immunity by adoptive transfer of HCMV-specific T cells is a safe and effective treatment option but is limited to haematopoietic stem cell transplantation. A novel protocol based on stimulation with overlapping peptide libraries followed by isolation of the IFN- γ secreting cells was developed in our group to generate HCMV specific T-cell lines from healthy volunteers. The aim of this study was to determine whether this protocol is applicable to generate functional HCMV- specific T cells from chronically immunosuppressed solid-organ-transplant (SOT) patients. Autologous CD4+/8+ T-cell lines directed against two immunodominant HCMV proteins were generated from the peripheral blood of SOT patients. Despite chronic immunosuppression, T-cell lines with HCMV-specific killing behavior were generated from 8/10 SOT patients. Cell lines recognized multiple epitope targets of the viral proteins and were oligoclonal at the T-cell receptor V-beta level. Additionally, the feasibility of the protocol to generate T-cell lines under clinical conditions was demonstrated and one patient was treated with HCMV specific T cells. These data indicate the potential of this procedure for application in clinical relevant situations, like treatment of SOT patients with HCMV infection resistant to virostatic therapy