Tissue Engineering von humanen kardiovaskulären Patches

TITLE PAGE CONTENTS ABBREVIATIONS AND ACRONYMS 1\. INTRODUCTION 4 2\. AIM OF THE STUDY 13 3\. MATERIALS AND METHODS 14 4\. RESULTS 36 5\. DISCUSSION 45 6\. CONCLUSIONS 51 7\. SUMMARY 52 8\. REFERENCES 53 9\. ACKNOWLEDGMENTS 64 10\. CURRICULUM VITAE 65 11\. STATEMENT IN LIEU OF OATH 67Background: One approach to tissue engineering has been the development of in vitro conditions for the fabrication of functional cardiovascular structures intended for implantation. In the current experiment, we developed a pulsatile flow system that provides biochemical and biomechanical signals in order to regulate autologous patch-tissue development in vitro. Methods: We constructed a biodegradable and biocompatible patch scaffold from porous poly-4-hydroxy- butyrate (P4HB; pore size: 80-150 micron, thickness: 0.5 mm, diameter: 45 mm; Tepha Inc., USA). The porous patch scaffold was seeded with pediatric aortic cells. The cell-seeded patch constructs were placed in a self-developed bioreactor, providing pulsatile flow and biomechanical stress for 7 days to observe potential tissue formation under dynamic cell culture conditions. As a control, porous patch scaffolds were seeded with pediatric aortic cells using the same experimental protocol without conditioning in our bioreactor system. Following maturation in vitro, analysis of the tissue engineered constructs included biochemical, morphological and immunohistochemical examination. Results: Macroscopically, all tissue engineered patch constructs were covered by tissue. After conditioning in the pulsatile flow bioreactor, the cells were mostly viable, grew into the pores and formed tissue on the porous patch construct. Electron microscopy showed smooth confluent smooth surfaces over the follow-up period. Additionally, we demonstrated the capacity to generate collagen and elastin under in vitro pulsatile flow conditions in our biochemical examination. Immunohistochemical examination stained positive for alpha-smooth muscle actin, collagen type 1 and fibronectin. There was minor tissue formation in the non-conditioned control samples. Conclusions: Porous P4HB may be used to fabricate a porous and biodegradable patch scaffold. The cells attached themselves to the polymeric scaffold, and extracellular matrix formation was induced under controlled biomechanical and biodynamic stimuli in a self-developed pulsatile bioreactor system.Das Ziel der Arbeit war, mit Hilfe des "Tissue Engineering" humane autologe kardiovaskuläre Patches herzustellen. Dazu wurde ein pulsatiles Flußsystem entwickelt, Welches biochemische und biomechanische Signale zum Regulieren der autologen Patchgewebeentwicklung in vitro bieten kann. Wir konstruierten Polymergerüst aus porösem, biokompatible und biodegradable Poly-4-hydroxy- butyrate (P4HB; Porengröße: 80-150um, Dicke: 0.5mm, Durchmesser: 45mm; Tepha Inc., USA). Das poröse Patch wurde mit Aortenzellen, die aus pädiatrischen Patienten entnommen wurden, besiedelt. Anschließend wurden 4 Zell-besiedelte Patch Konstrukte in den bioreaktor eingesetzt und unter dynamischer Zellkultur kondition für 7 Tagen inkubiert. Als Kontrollen, andere 4 Zell-besiedelte Patch Konstrukte wurden ohne dynamische Konditionierung, sondern unter statischen Bedingungen kultiviert. Nach 7 Tagen, die tissue-engineerten Patch Konstrukte wurden aus dem Bioreaktor entnommen und mit den parallel statisch behandelten Patches morphologisch, immunhistochemisch und biochemisch evaluiert. Alle tissue-engineerten Patch Konstrukte waren aus histologischer Sicht mit Zellen bedeckt. Nach der dynamischen Konditionierung im pulsatilen Bioreaktor, die meisten Zellen waren lebensfähig. Zusätzlich wuchsen die Zellen von der Oberfläche in die Poren der konditionierten Patch Konstrukte hinein und bildeten gewebe heraus. Elektronenmikroskopische Untersuchung zeigte sich, dass bei den konditionierten Konstrukten mehrschichtig adhärente Zellen an der Oberfläche des Polymergerüstes erkennbar waren und beide Oberfläche mit glatten, homogenen Geweben bedeckt waren. Zudem durch biochemische Untersuchungen konnte die Fähigkeit der Synthese der extrazellulären Matrixprotein Kollagen und Elastin unter in vitro pulsatilen Flusskonditionierung nachgewiesen werden. Die tissue engineerten Patch Konstrukte haben sich weiterhin positiv für alpha-Smooth muscle Aktin, Kollagen I und Fibronektin gezeigt. Es wurde aslo gezeigt, dass wenige Tissue sich auf den statischen kultivierten Patch Konstrukten herausgebildet haben. Wir folgern daraus, dass porös P4HB als Polymergerüst Matelial für humanes autologes tissue- engineerten Patch verwendet werden kann. Die Humane vaskuläre Zellen kann auch als Zellquelle im Tissue Engineering von kardiovaskulären Patches benutzt werden. Das neuentwickelte pulsatile Patch Bioreaktorsystem kann nicht nur biochemische sondern biodynamische und biomechanische Stimulus für in vitro Zellkultur und Tissueentwicklung initieren, deshalb kann es einen günstigen Einfluss auf humane autologe Patch Tissueentwicklung nehmen