description of two novel species Arcanobacterium bialowiezense and Arcanobacterium bonasi

Deckblatt-Impressum persönlicher Dank Inhaltsverzeichnis Einleitung Literaturübersicht Problemstellung und Ziele Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Danksagung SelbständigkeitserklärungDer Białowieża Nationalpark erstreckt sich zu beiden Seiten der Grenze zwischen Polen und Weißrußland. Nach dem zweiten Weltkrieg wurde er in zwei Teile geteilt. Heute gehören zum polnischen Teil 594 km2 und zu dem weißrussischen 874 km2. ImBiałowieża Nationalpark lebt die weltweit größte freilebende Wisentpopulation. In dieser Population erkranken seit 1980 regelmäßig eine große Zahl der Bullen an einer chronisch nekrotisierenden Entzündung des Präputiums und des Penis (Balanoposthitis). Der Wisent wird innerhalb der Familie Bovidae (Gray, 1872) in die Subfamilie Bovinae (Gray, 1821) eingeordnet. Er gehört zu der Gattung Bison, welche die beiden Arten Bison (Bison bison, Linnaeus, 1758) und Wisent (Bison bonasus, Linnaeus, 1758) umfasst. Der Wisent ist eine bedrohte Tierart (Appendix III (geschützte Tierart) der Berner Konvention zum Schutz der Lebensräume wildlebender Pflanzen und Tiere, bedrohte Art auf der IUCN roten Liste der bedrohten Tierarten) und die Balanoposthitis bedeutet ein ernst zu nehmendes Problem für die in Białowieża existierende Wisentpopulation (Anonymous, 2002). 1980 wurde erstmalig eine chronische Erkrankung des äußeren Geschlechtsapparates bei Wisentbullen beschrieben (Kita et al., 1994). Charakteristisch für fortgeschrittene Erkrankungsstadien sind die Ödematisierung der Haut um die Präputialöffnung herum, und die Ansammlung von eitrigem Exsudat sowie nekrotischem Gewebe in der Präputialhöhle. Im Spätstadium kann es zu Paraphimose, Verklebung von Präputium und Penis sowie Autamputation der Penisspitze kommen. Histopathologisch wird das nekrotische Gewebe durch einen Demarkationswall aus Entzündungszellen und Granulationsgewebe vom darunterliegenden Bindegewebe abgetrennt (Jakob et al., 2000). Im Spätstadium der Balanoposthitis erkrankte Bullen können durch die entzündlichen und nekrotischen Veränderungen an ihrem Präputium, die auch auf den Penis übergreifen, nicht mehr am Reproduktionsgeschehen teilnehmen. Durch den regelmäßigen Ausfall der an Balanoposthitis erkrankten Bullen (zwischen 5 und 10% pro Jahr) wird das genetische Potential der Białowieża Population vermutlich weiter eingeschränkt. Daher war es Ziel dieser Arbeit die ursächliche oder sekundäre Beteiligung bestimmter Bakterien an der Balanoposthitis abzuklären. Weiterhin sollte ein Überblick über die bakteriologische Normalflora sowohl des männlichen als auch des weiblichen Geschlechtstrakts der Wisente in Białowieża gewonnen werden. Zu diesem Zweck wurden Tupferproben von gesunden und erkrankten Wisentbullen sowie Wisentkühen entnommen und bakteriologisch untersucht. Aus Tupferproben an Balanoposthitis erkrankter Bullen wurden dabei zwei Bakterien isoliert welche der morphologischen Beschreibung von A. pyogenes entsprachen. Der Stamm W3/01 und der Stamm W106/04 zeigten aber keine Serolyse auf Löffler Agar und unterschieden sich auch in den enzymatischen Reaktionen von A. pyogenes. Eine vergleichende 16S rDNA Analyse ordnete die Isolate W3/01 und W106/04 eindeutig in die Gattung Arcanobacterium ein. Die höchste Ähnlichkeit bestand zu A. pyogenes (96,1% und 96,4%) und A. bernardiae (95,5% und 95,8%). Untereinander waren die Isolate zu 97,2% identisch. Das Isolat mit der Stammbezeichnung W3/01 wurde unter der Speziesbezeichnung Arcanobacterium bialowiezense sp. nov. und das Isolat mit der Stammnummer W106/04 unter der Speziesbezeichnung Arcanobacterium bonasi sp. nov. bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig) hinterlegt. A. bialowiezense oder A. bonasi wurden bei 87% der kranken Bullen nachgewiesen, aber weder bei gesunden Bullen noch bei den weiblichen Tieren gefunden. Die phylogenetische Verwandtschaft zu A. pyogenes unterstreicht eine mögliche Bedeutung in der Ätiologie und Pathogenese der Balanoposthitis beim Wisent. Es ist denkbar, dass die beiden Isolate auch ähnliche Virulenzfaktoren besitzen und somit am Krankheitsgeschehen der Balanoposthitis beteiligt sein können. Momentan ist es nur möglich eine Hypothese über den Verlauf der Krankheit aufzustellen und diese als Basis für weitere Untersuchungen zu verwenden. Demnach kommt es möglicherweise durch prädisponierende Faktoren zu einer Vorschädigung des Gewebes mit der anschließenden Ausbildung einer fokalen Hyperkeratose. Eventuell liegt auch ein genetischer Defekt zugrunde, der in der geringen genetischen Variabilität der Wisente begründet ist und zu einer Störung der lokalen Immunabwehr führt (Lünser et al., 2005). Ein solcher Defekt hätte zur Folge, dass Krankheitserreger leichter in die Haut einwandern und sich dort vermehren können. In vorangegangenen Untersuchungen wurde die Beteiligung von Fusobakterien an der Balanoposthitis des Wisents nachgewiesen (Jakob et al., 2000). Durch einen Synergismus von Fusobakterien mit den beiden neuen Spezies A. bonasi und A. bialowiezense könnte die Infektion noch verstärkt werden wie es für A. pyogenes und F. necrophorum beschrieben ist (Kaczmarowski, 2003). Aufgrund der hohen Verwandtschaft der beiden Arcanobacterium spp. zu A. pyogenes kann man vermuten, dass sie ähnliche Virulenzfaktoren besitzen. Neuraminidasen unterstützen die Anhaftung der Arcanobakterien an Hautzellen, wodurch sie in der Lage sind die Haut zu besiedeln (Esmay et al., 2003). PLO, ein haemolytisches Exotoxin (Ding, 1996; Billington, 1997), wirkt zytolytisch indem es an Membranen tierischer Zellen bindet und dort oligomere Poren bildet (Billington, 2000). Es ist außerdem beschrieben, dass PLO die Komplementkaskade aktiviert (Paton, 1984). Bei einer überschiessenden Reaktion kann dies zu Entzündungsreaktionen und Nekrosen führen (www.mucos.cz). Da es möglich war einen der Erreger mittels PCR bei einem Bullen in Stadium I der Erkrankung nachzuweisen ist nicht auszuschließen, dass die Arcanobakterien primär an der Balanoposthitis beteiligt sind.The Białowieża National Park is situated on both sides of the border between Poland and Belarussia. After the second world war it was separated into the Polish and the Belarussian part. Today the Polish part comprises 594 km2 and the Belarussian part 874 km2. The largest of the few remaining free-ranging populations of European bison exists in the Białowieża Primeval Forest. Since 1980 a chronic necrotising disease of the prepuce and penis (Balanoposthitis) has been observed in this population. The European (E.) bison belongs to the family Bovidae (Gray, 1872), the subfamily Bovinae (Gray, 1821) and the genus bison. There are two species classified within the genus bison: the European bison (Bison bonasus) and the North American bison (Bison bison). The European bison is a threatened species (Appendix III (protected fauna species) of the Bern Convention on the conservation of European wildlife and natural habitats, endangered species on the 2003 IUCN Red List of Threatened Species) and the Balanoposthitis is a serious problem for the present Białowieża population (Anonymous, 2002). A chronic necrotizing inflammation of the external genital organs of male E. bison was first described in 1980 (Kita et al., 1994). Advanced disease is characterized by crushing of the hairs around the preputial orifice, edema of the surrounding skin, and accumulation of thick exudate and necrotic tissue within the preputial cavity. In addition, paraphimosis, constriction of the distal penis, and in some cases necrosis and auto-amputation of the glans penis, have been observed. Histopathologically, the necrotic tissue is demarcated from the underlying connective tissue by inflammatory cells and granulation tissue. Numerous lymphoid follicles in the surrounding connective tissue are also present (Jakob et al., 2000). Due to the inflammatory and necrotic changes of the prepuce and penis in late stages of Balanoposthitis affected bulls are not able to take part in reproduction. This regular loss of bulls (between 5 and 10% per year) obviously leads to a further reduction of the genetic potential of this threatened species. For this reason the objective of this study was to investigate whether certain bacteria are primarily or secondarily involved in the disease process of the Balanoposthitis. Additionally, a survey of the physiological bacteriological flora of the male and female E. bison genital tract was conducted. For this purpose genital samples of healthy and diseased bulls as well as female E. bison were examined bacteriologically. From genital swabs of bulls showing Balanoposthitis two new bacteria were isolated which were morphologically similar to Arcanobacterium (A.) pyogenes. However strain W3/01 and strain W106/04 showed no serolysis on Löffler serum Agar and they also differed in enzymatic reactions from A. pyogenes. 16S rDNA sequence analysis showed that the two isolates W3/01 and W106/04 shared 97.2% sequence similarity. Highest sequence similarities (95.5-96.1%) to A. pyogenes DSM 20630 and A. benardiae DSM 9152 were found. The isolates with strain numbers W3/01 and W106/04 were deposited at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig) under the species name of Arcanobacterium bialowiezense sp. nov. and Arcanobacterium bonasi sp. nov., respectively. A. bialowiezense or A. bonasi were isolated from 87% of the diseased bulls, but not from healthy bulls or female E. bison. The phylogenetic relationship to A. pyogenes underlines a possible role in the etiology and pathogenesis of the Balanoposthitis. It is possible that both isolates have virulence factors similar to A. pyogenes, and for this reason they might be involved in the disease process. At this stage it is only possible to hypothesize about the process of the disease and use this as a basis for further studies: Predisposing factors might scarify the tissue resulting in a hyperkeratosis. Possibly a genetic defect due to the low genetic variability leads to a failure of the local immune response (Lünser et al., 2005). This would make it easier for pathogenic microorganisms to invade the skin and proliferate. In preliminary studies involvement of Fusobacteria was demonstrated (Jakob et al., 2000). A synergism between Fusobacterium (F.) spp. and A. bonasi and A. bialowiezense could further enhance the infection as it has been described for A. pyogenes und F. necrophorum (Kaczmarowski, 2003). The phylogenetic relationship of these two Arcanobacterium spp. to A. pyogenes leads to the assumption that they might have similar virulence factors: Neuraminidase promotes the adherence of Arcanobacterium spp. to skin cells, which enables them to colonize the skin (Esmay et al., 2003). PLO, a hemolytic Exotoxin (Ding, 1996; Billington, 1997), has a cytolytic effect through binding to the membranes of animal cells and building large oligomere pores (Billington, 2000). PLO also activates the complement cascade (Paton, 1984). By overreacting this can lead to inflammation and necrosis (www.mucos.cz). As DNA of one of the new Arcanobacterium spp. was isolated by PCR in a bull at Stage I of the disease it is not possible to exclude a primary etiological role in the disease process