Studies on the reconstitution of SNARE-mediated membrane fusion

Die Bildung von SNARE-Komplexen ist ein Charakteristikum der meisten intrazellulären Fusionsreaktionen. SNARE-Komplexe bestehten aus vier parallelen α-Helices, die durch konservierte Sequenzen gebildet werden, die SNARE-Motive. SNARE-Proteine sind über C-terminale Transmembransegmente oder Lipidmodifikationen in der Membran verankert. Nach dem zipper-Modell wird die Interaktion zwischen SNARE-Proteinen, die in gegenüberliegenden Membranen sitzen, an deren N-Termini initiiert und schreitet dann C-terminal in Richtung der Transmembrananker fort. Die dabei freiwerdende Konformationsenergie wird zur Überwindung der Energiebarriere bei der Fusion benutzt. Die Freisetzung von Neurotransmittermolekülen bei der Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Plasmamembran ist ein essentieller Vorgang für die Kommunikation zwischen Nervenzellen. Der daran beteiligte synaptische SNARE- Komplex besteht aus den Proteinen Syntaxin 1 (Qa-SNARE) und SNAP-25 (Qbc- SNARE), die in der Plasmamembran sitzen, und Synaptobrevin (R-SNARE), das in der Membran von synaptischen Vesikeln angereichert ist. Die SNARE-Motive von Syntaxin und Synaptobrevin bilden jeweils eine Helix im neuronalen SNARE- Komplex, während SNAP-25 zwei Helices beisteuert. Die Erhöhung der präsynaptischen Ca2+-Konzentration beschleunigt die Freisetzung von Neurotransmitter aus synaptischen Vesikeln dramatisch. Physiologische Untersuchung an Maus- und Drosophilamutanten zeigten, dass Synaptotagmin 1 als Ca2+-Sensor in diesem Prozess wirkt. Synaptotagmin 1 ist in der Membran des synaptischen Vesikels durch eine N-terminale Transmembranregion verankert, seine zwei cytoplasmatischen C2 Domänen interagieren Ca2+-abhängig mit Membranen, die anionische Phospholipide enthalten. Daneben ist die Bindung von Synaptotagmin an monomere und heterooligomere SNAREs in An- und Abwesenheit von Ca2+ beschrieben, wobei unklar ist, welche dieser Interaktionen physiologisch relevant sind. Einige Arbeiten haben versucht, die Abläufe bei der synaptischen Membranfusion in einem rekonstituierten System zu rekapitulieren. Wenn gereinigte SNARE-Proteine in künstliche Phospholipidvesikel rekonstituiert werden, treibt die Bildung von SNARE Komplexen die Fusion dieser Liposomen an. Die beobachteten Reaktionsraten sind jedoch ausgesprochen langsam. Weiterhin wurde gezeigt, dass ein cytoplasmatisches Fragment von Synaptotagmin 1, das beide C2-Domänen umfasst, die Fusion von Liposomen Ca2+-abhängig um etwa den Faktor zwei beschleunigt. Einige Aspekte dieser Beschleunigung sind jedoch schwer mit den bekannten Merkmalen der Ca2+-abhängigen Exozytose in Einklang zu bringen. Erstens bleiben die Fusionsraten auch in Gegenwart des C2AB-Fragments und Ca2+ um mehrere Größenordungen hinter jenen zurück, die in Neuronen oder neuroendokrinen Zellen beobachtet werden. Außerdem wurde nur eine Beschleunigung durch das C2AB-Fragment von Synaptotagmin beschrieben, während die Korekonstitution des gesamten Proteins mit Synaptobrevin zu einer Beschleunigung in Abwesenheit von Ca2+ führt. Um zu einem tieferen Verständnis der neuronalen Exozytose beizutragen, wurde in dieser Arbeit die SNARE- vermittelte Fusion von Liposomen und der Einfluss von Synaptotagmin auf sie im Detail untersucht. Dazu wurden die neuronalen SNARE-Proteine aus E. coli gereinigt und in Liposomen rekonstituiert. Nach einer sorgfältigen Charakterisierung der Liposomen wurde gezeigt, dass die Fusion von Liposomen strikt von der Formierung des ternären SNARE-Komplexes abhängig ist. Eine Analyse der Reaktivität verschiedener Q-SNARE-Komplexe und der von ihnen angetriebenen Fusionsreaktionen ergab, dass die Fusionsraten von der Verfügbarkeit eines Qabc-Akzeptorkomplexes als der Bindungsstelle für Synaptobrevin bestimmt werden. Unter normalen Bedingungen ist diese Bindungsstelle blockiert und die Fusion läuft folglich langsam ab. Eine Stabilisierung des Akzeptorkomplexes resultierte in einer dramatischen Beschleunigung der Fusion um mehr als eine Größenordnung. Als nächstes wurde der Effekt von Synaptotagmin auf die Liposomenfusion untersucht. Eine systematische Analyse der Lipid- und SNARE-Bindung zeigte, dass die Beschleunigung der Reaktion durch das C2AB-Fragment auf eine Ca2+-abhängige Rekrutierung an die Synaptobrevin-Membran und eine Ca2+-unabhängige Interaktion mit den Q-SNAREs zurückzuführen ist. Die Verwendung von Synaptotagmin-Mutanten, die in elektophysiologischen Studien untersucht worden sind, zeigte weiterhin, dass einige zentrale Eigenschaften Synaptotagmins in der SNARE-vermittelten Fusion von Liposomen nicht reproduziert werden. Bei Rekonstitution von Synaptotagmin mit Synaptobrevin wird die unphysiologische Rekrutierungsreaktion umgangen. In diesem Fall wurde eine Beschleunigung der Fusion in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet, die auf einer Ca2+-unabhängigen Bindung an die neuronalen Q-SNAREs beruht. In Gegenwart von Ca2+ wurde hingegen eine Inhibition dieser Reaktion beobachtet, die mit einer Interaktion Synaptotagmins mit der eigenen Membran erklärt wurde (cis-Interaktion). Wurde diese Interaktion verhindert, beschleunigte eine Ca2+-abhängige Bindung Synaptotagmins an Phospholipide in der Q-SNARE-Membran (trans-Interaktion) die Reaktion. Die Verwendung des stabilisierten Qabc-Akzeptorkomplexes offenbarte, dass weder das C2AB Fragment noch korekonstituiertes Synaptotagmin eine Reaktion beschleunigen, in der die Initiierung der SNARE-Interaktion nicht geschwindigkeitsbestimmend ist. Dies zeigt, dass Synaptotagmin zumindest in diesem System vor der SNARE-Interaktion wirkt bzw. diese stimuliert. Meine Arbeit zeigt, dass die Assemblierung von SNARE-Proteinen Membranen in einem biologisch sinnvollen Zeitrahmen fusionieren kann. Zuvor widersprüchliche Ergebnisse zum C2AB-Fragment von Synaptotagmin und dem gesamten Protein werden miteinander in Einklang gebracht. Diese Untersuchung zeigt jedoch auch, dass die Wirkung von Synaptotagmin auf die synaptische Fusionsmaschinerie bisher nicht in vitro rekapituliert worden ist. Für ein vollständiges Verständnis dieses Vorgangs ist es wichtig, die molekulare Struktur des SNARE-Komplexes vor dem Calcium-Stimulus näher zu untersuchen.Most intracellular membrane fusion events involve the formation of SNARE complexes. These complexes are composed of four parallel α-helices, each of which is provided by conserved sequences, termed SNARE motifs. SNARE proteins are anchored to the membrane via C-terminal transmembrane domains or by lipid- modifications. According to the current model of membrane fusion, SNARE proteins initially form contacts at their N-terminal ends. In a zipper-like fashion, the four helical bundle then forms towards the C-terminus, pulling the two membranes into close apposition and finally overcoming the energy barrier for the merger of the two membranes. Synaptic vesicle fusion results in the secretion of neurotransmitters, a process essential for inter-neuronal communication. The synaptic SNARE complex is formed by the proteins syntaxin 1 (Qa-SNARE) and SNAP-25 (Qbc-SNARE) that reside on the plasma membrane, and synaptobrevin (R-SNARE) which is enriched on the membrane of synaptic vesicles. Syntaxin 1 and synaptobrevin each provide one SNARE-motif to the complex, whereas SNAP-25 contributes two SNARE motifs. The release of neurotransmitter from synaptic vesicles is dramatically accelerated by elevation of intracellular calcium. Physiological analysis of mouse and fly mutants has revealed that synaptotagmin 1 acts as the Ca2+ sensor in this process. Synaptotagmin 1 is anchored to the synaptic vesicle membrane through its N-terminal transmembrane region. Its two cytoplasmic C2-domains interact with membranes containing acidic phospholipids in a Ca2+-dependent manner. Furthermore it has been shown, that these C2 domains interact with monomeric and heterooligomeric SNAREs both in the absence and presence of calcium. The relative contributions of these two binding modes in the context of synaptic fusion are controversial. It was shown before that assembly of purified neuronal SNARE proteins, when reconstituted in artificial phospholipid vesicles, is able to drive membrane fusion, albeit at very low reaction rates. A fragment of synaptotagmin 1, encompassing both cytoplasmic C2 domains, accelerates this reaction in a Ca2+-dependent manner by a factor of approximately two. Several aspects of the observed acceleration of liposome fusion by the C2AB fragment, however, are difficult to reconcile with the established features of neurotransmitter release. First, the observed fusion rates are still orders of magnitude slower than synaptic exocytosis. Second, only Ca2+-dependent acceleration by the C2AB fragment of synaptotagmin 1 has been observed, whereas the full-length reconstituted protein accelerates liposome fusion in the absence of Ca2+. In an effort to shed light on the mechanism of Ca2+-dependent exocytosis, I investigated the SNARE mediated fusion of liposomes and the effect of synaptotagmin on it in greater detail. Neuronal SNARE proteins purified from E. coli were reconstituted in liposomes, and after a thorough characterization in terms of size distribution and protein incorporation, the fusion between them was shown to strictly depend on the formation of the 4-helical SNARE bundle. Analysis of the reactivity of different Q-SNAREs in binding to synaptobrevin and driving fusion, revealed that fusion rates are dictated by the availability of a Qabc acceptor complex. Under normal conditions this binding site is blocked and fusion is therefore largely retarded. Stabilization of the acceptor complex and its reconstitution in liposomes resulted in an acceleration of liposome fusion by more than an order of magnitude. Next, I investigated the influence of the synaptotagmin 1 on liposome fusion. Testing systematically its lipid- and SNARE-binding properties it turned out that the acceleration by the C2AB fragment is readily explained by a Ca2+-dependent recruitment of the fragment to the synaptobrevin-membrane and a Ca2+-independent interaction with the neuronal Q-SNAREs. Furthermore, using synaptotagmin-mutants which had been previously examined by electrophysiology, it was found that several important properties of synaptotagmin are not reproduced in the liposome fusion system. Reconstitution of full-length synaptotagmin with synaptobrevin circumvented the non-physiological recruitment reaction and led to an acceleration in the absence of Ca2+ due to an interaction with the neuronal Q-SNAREs. Ca2+-dependent binding of synaptotagmin to its own membrane impedes the activation. Preventing this cis-interaction allows Ca2+ to trigger synaptotagmin binding to the opposing membrane (trans), accelerating fusion. However, when an activated SNARE acceptor complex was used, synaptotagmin had no effect on fusion kinetics, suggesting that it operates upstream of SNARE assembly in this system. These results show that SNAREs when present in an activated state are able to drive membrane fusion on a biologically meaningful time scale. Furthermore, they resolve major discrepancies concerning the effects of full-length synaptotagmin and its C2AB fragment on liposome fusion, but also show that the action of synaptotagmin on the fusion-arrested state of docked vesicles in vivo is not fully mimicked in vitro. For the future it will be crucial to understand the molecular structure of the late-arrested state of a docked and primed vesicle, particularly with respect to the state of SNARE assembly