Genetische Zerlegung von Proteinen der aktiven Zone

Active zones are highly-specialized sites in the presynaptic bouton that are essential for neurotransmitters release. The molecular machinery mediating the fusion of synaptic vesicles (SVs) at presynaptic active zone membranes has been studied in detail, and several essential components have been identified. Active zone associated protein scaffolds were so far viewed as rather modulatory for transmission. Bruchpilot (BRP), a large coiled-coil domain protein of the mammalian CAST/ELKS family, was previously shown to be essential for both the structural and functional integrity of the presynaptic active zone cytomatrix (CAZ) at Drosophila synapses. To identify further components forming the active zone cytomatrix, additional candidate active zone scaffold proteins were characterized by combining genetic with physiological analysis at NMJ model synapses. Rab3 Interacting Molecules (RIMs) are evolutionary conserved scaffolding proteins that are localized at AZs and studies in mammals have shown important synaptic roles for RIMs in SV docking and priming. To thoroughly examine the function of RIM at the Drosophila NMJ, we subjected the rim locus to genetic analysis. Several intragenic mutants of rim could be identified by means of deletion screenings. Surprisingly, adult vitality and locomotive behavior were only partially affected in these mutants. Next, the Drosophila ortholog of mammalian RIM- Binding Protein (DRBP) was subjected to genetic analysis. Intragenic null alleles were created by chemical mutagenesis. Adult vitality and locomotive behavior of larval drbp mutants were significantly impaired. All phenotypes of the mutants could be rescued by introducing one copy of a drbp genomic construct. Further characterizations of the drbp null allele revealed that DRBP is a direct building block of the active zone cytomatrix, and critical for efficient neurotransmitter release. The discovery of DRBP calls for the identification of additional molecular components in the BRP/DRBP matrix and the detailed analysis of how DRBP functions in active zone assembly. Finally, immuno-stainings showed that BRP and DRBP are not equally distributed over CNS synapses. Instead, DRBP rich and poor active zone populations were easily retrieved. To assign these different classes to particular neuronal populations, subtype specific expression using GAL4 lines was combined with previously designed transgenic tools (e.g. GFP-labeled acetylcholine receptor and BRP-derived constructs). DRBP-rich synapses were found to be preferentially enriched at presynaptic terminals of mushroom body Kenyon cells. In the antennal lobes, a much lower endogenous DRBP level was detected at olfactory receptor neuron presynapses, while DRBP-rich synapses were found at the inhibitory local interneuron active zones. This data might help in the anatomical description of synapse identities throughout the Drosophila circuits. Moreover, active zone protein composition diversity might be an important means of functional diversification.Aktive Zonen sind für die Neurotransmitterfreisetzung spezialisierte Bereiche im präsynaptischen Bouton, wo synaptische Vesikel (SV) akkumulieren und andocken. Die molekulare Maschinerie, die die Fusion synaptischer Vesikel mit der Plasmamembran der präsynaptischen aktiven Zone vermittelt, war in der Vergangenheit bereits Gegenstand detaillierter Studien, welche zur Identifikation mehrerer essentieller Komponenten geführt haben. Bisher galten Gerüstproteine der aktiven Zone vor allem als Modulatoren der Signalübertragung. Es wurde bereits gezeigt, dass Bruchpilot (BRP), ein Protein mit ausgedehnten coiled-coil Regionen und Homologie zur CAST/ELKS Familie, essentiell für sowohl die strukturelle wie die funktionelle Integrität der Cytomatrix der präsynaptischen aktiven Zone (CAZ) in Drosophila Synapsen ist. In dieser Studie wurden in NMJ Modellsynapsen weitere Gerüstproteine mit genetischen und physiologischen Methoden identifiziert und charakterisiert. Rab3 Interacting Molecules (RIM) sind evolutionär konservierte Gerüstproteine, für die in Säugern eine wichtige Rolle bei Neurotransmitterfreisetzung nachgewiesen wurde. Zunächst wurde die Rolle von RIM in NMJ Modellsynapsen durch genetische Analyse des rim Lokus untersucht. Deletionsscreening führte zur Identifikation mehrerer rim-Mutanten, doch Vitalität und lokomotives Verhalten adulter Fliegen waren überraschenderweise nur partiell beeinträchtigt. Weiterhin wurde das Drosophila-Orthologe des RIM- Binding Protein (DRBP) einer genetischen Analyse unterzogen und es wurden durch chemische Mutagenese intragenische Nullallele erzeugt. drbp mutante Larven wiesen ein erheblich gestörtes lokomotives Verhalten auf, und auch die Vitalität adulter Fliegen war stark beeinträchtigt. Die Einführung eines genomischen Rettungskonstrukts stellte die normale Transmission und Vitalität wieder her. Durch weitere Charakterisierung des drbp Nullallels konnte gezeigt werden, dass es sich bei DRBP um einen integralen Baustein der Zytomatrix der aktiven Zone handelt, der bei der Freisetzung von Neurotransmittern eine kritische Rolle spielt. Die Entdeckung dieses essentiellen Faktors unterstreicht, dass es für das Verständnis der präsynaptischen aktiven Zone entscheidend sein wird, in Zukunft ein vollständigeres Bild jener Komponenten zu gewinnen, welche mit der BRP/DRBP-Matrix interagieren. Mittels Immunfärbung konnte schließlich gezeigt werden, dass BRP und DRBP nicht gleichmäßig über ZNS-Synapsen verteilt sind. Stattdessen konnten DRBP-reiche und -arme Synapsenpopulationen identifiziert werden. Um diese verschiedenen Synapsen bestimmten Neuronen-Subtypen zuzuordnen, wurden subtypenspezifische GAL4 Treiberlinien mit bereits zuvor erstellten transgenen Werkzeugen (z.B. GFP- markierte Acetylcholin-Rezeptoren und fluoreszent-markierte BRP Konstrukte) kombiniert. Synapsen mit hohem DRBP Level waren hauptsächlich in den Präsynapsen von Kenyon Zellen im Pilzkörper zu finden. In den Antennalloben wurde ein niedriger endogener DRBP-Level in Präsynapsen olfaktorischer Rezeptorneuronen gefunden, während DRBP-reiche Synapsen in den lokalen inhibitorischen Interneuronen vorhanden waren. Diese Daten erlauben nicht nur eine bessere anatomische Zuschreibung von Synapsen-Identitäten in den neuronalen Netzwerken von Drosophila, es besteht auch die Möglichkeit, dass die Diversität in der Zusammensetzung der aktiven Zone mit einer funktionalen Diversifizierung korrespondiert