Fortschrittliche Markierungsstrategien für die strukturelle Untersuchung der Membranproteindynamik durch Festkörper-MAS-NMR-Spektroskopie

1 Introduction 1 1.1 Different techniques to study membrane proteins. 2 1.1.1 Expression, isolation, purification and (re)folding of membrane proteins. 3 1.1.2 Three-dimensional (3D) crystallisation and X-ray crystallography. 9 1.1.3 Electron crystallography and two-dimensional (2D) crystallisation. 10 1.1.4 Atomic force microscopy (AFM) and single molecule force spectroscopy (SMFS). 14 1.1.5 Solution and solid-state NMR. 15 1.2 Basic elements for nuclear magnetic resonance. 19 1.2.1 Solid-state NMR. 23 1.2.2 Basic solid- state MAS NMR techniques. 25 1.2.2.1 Spin diffusion. 27 1.2.2.2 Recoupling techniques. 28 1.2.2.3 Assignment of solid-state MAS NMR spectra. 29 1.3 System for membrane protein studies. 30 1.3.1 Amphipols. 31 1.3.2 Lipid bilayer systems. 31 1.3.3 Bicelles. 31 1.3.4 Nanolipoprotein particles. 32 1.3.5 Lanthanides in structural biology by NMR. 33 1.4 The outer membrane protein G (OmpG) from E. coli. 33 1.5 Overview of the thesis. 41 2 Material and Methods 43 2.1 Material. 43 2.1.1 E. coli expression and cloning strain. 43 2.1.2 Expression plasmid. 43 2.1.3 Isotopically labelled substances. 44 2.1.4 Accessories and devices. 44 2.2 Methods. 45 2.2.1 Preparation of Competent cells. 45 2.2.2 Transformation of pET26 in E. coli BL21(DE3). 45 2.2.3 Test expression of OmpG fragment in E. coli BL21(DE3) pET26. 45 2.2.4 SDS gel electrophoresis for the separation of proteins. 46 2.2.5 Main media. 46 2.2.6 Determination of protein concentration. 47 2.2.7 Expression of labelled and unlabelled OmpG in E. coli BL21(DE3). 47 2.2.7.1 Isotopically labelled supplements for different labelling-scheme. 47 2.2.7.2 Standard expression protocol . 48 2.2.7.3 Modified expression protocol (Marley et al., 2001). 48 2.2.7.3.1 Expression protocol of [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG. 49 2.2.7.3.2 Expression protocol of [13C, 15N]-GENDPQASR-OmpG. 49 2.2.8 Protein purification from inclusion bodies. 51 2.2.9 OmpG refolding. 51 2.2.10 Vivapure IEX spin columns. 52 2.2.11 Reconstitution into lipid bilayers and two-dimensional crystallisation. 52 2.2.12 Electron microscopy analysis. 53 2.2.13 Solid-state MAS NMR spectroscopy. 53 2.2.13.1 1D 13C- and 15N-CP/MAS experiments. 54 2.2.13.2. 2D 13C-13C PDSD experiments. 55 2.2.13.3 2D NCO experiments. 55 2.2.13.4 NMR Data processing and analysis. 55 3 Results and Discussion 56 3.1 Protein labelling strategy: [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG. 57 3.1.1 Expression and purification of the [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG and U-[13C, 15N]-OmpG. 60 3.1.2 A modified expression protocol. 66 3.1.3 Refolding of [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG and U-[13C, 15N]-OmpG. 67 3.1.4 2D crystals of reconstituted [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG. 69 3.1.5 Solid-state MAS NMR characterisation: [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG. 72 3.1.5.1 Going back to the preparation of the labelled sample at pH 5.6? 75 3.1.5.2 Going new ways 77 3.1.5.3 Final NMR characterisation: [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG. 81 3.2 Protein labelling strategy: [13C, 15N]-GEQNDPASR-OmpG. 88 3.2.1 Expression and purification of unlabelled GENDQPASR-OmpG in E. coli without signal sequence. 90 3.2.2 Analysis of the expression and purification in unlabelled form. 91 3.2.3 Expression and purification of the labelled [13C, 15N]-GENDPQARS-OmpG sample from inclusion bodies. 95 3.2.4 Refolding and 2D crystals reconstitution of the [13C, 15N]-GENDPQARS-OmpG. 97 3.2.5 Solid-state MAS NMR characterisation of the [13C, 15N]-GENDPQARS-OmpG. 101 3.3 Extending the mixing time: [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG. 104 3.4 Low buffer concentration: [13C, 15N]-GALVSHFα,βYα,β-OmpG. 108 4 Conclusion and Outlook. 111 Summary. A Zusammenfassung. C References. - 1 - Appendix. a Index of figures. a Index of tables. d Curriculum vitae -A-Membrane proteins represent one third of all proteins in most genomes and carry out a wide range of essential cellular functions. They transport ions and metabolites across the lipid membranes that surround cells and intracellular organelles, convert light energy to chemical energy, fuse the membranes of two cells, and transmit chemical signals across the membrane to regulate cell growth and division. It is known that the mutation, the misfolding and malfunctioning of membrane proteins can cause devastating diseases. Thus, membrane proteins are of significant biological and medical importance since they represent over 50 % of the current drug targets. Although a number of biophysical techniques including X-ray crystallography, electron microscopy and solution NMR spectroscopy have been used to determine membrane protein structures, these methods are unable to replicate and accommodate the complexity and diversity of natural membrane proteins. Additionally, X-ray crystallography and electron microscopy require highly diffracting 3D and 2D crystals, respectively. Solid-state MAS NMR is a versatile method for structural biology and can be used to provide new insights into the structures of membrane components and their mutual interactions. The extensive variety of sample forms amenable for study by solid-state MAS NMR allows data to be collected from proteins in conditions that are more similar to those of the native environment, and therefore are much closer to a functional state. In this thesis, different labelling strategies for structural characterisation of MP studies were tested by solid- state MAS NMR. The determination of large proteins by NMR is frequently hampered by several major problems, including the complexity of crowded spectra, fast nuclear relaxation, low sensitivity and the lack of precise conformational constrains. The development of sample labelling, in particular with NMR visible isotopes, become a commonly employed strategy. In NMR of large proteins sample labelling allows to improve methods for protein production and devise more sophisticated and elegant labelling strategies. The aim of isotope labelling is to increase the sensitivity and resolution, to simplify the complexities of spectra and to narrow the line widths. The labelling strategy used in this thesis is the selective labelling. For the preparation of these labelled samples were considered the cross labelling and isotopic dilution that sometimes can be reduced by increasing and decreasing the concentration of the appropriate unlabelled amino acids in the media as a compensatory effect. Here were produced different selectively labelled OmpG samples and the spectral overlap was decreased in comparison to the uniformly labelled sample of OmpG with the aim to extend the number of assignment possibilities. The assignment used in this thesis is the intraresidual assignment which represents the identification of all the labelled AAs in a spin system. It was done on 2D 13C-13C spectra of labelled OmpG. The labelling preparation types are described for different labelled OmpG samples for solid- state MAS NMR studies. A prerequisite for NMR study is the amount of recombinant protein (more than 10 mg). This requisite is satisfied in both labelled samples prepared. The results from this work, combined with data found in literature, show that this highly diffracting crystalline material is not a prerequirement for structural analysis of MPs for solid-state MAS NMR. It is possible to use poorly diffracting 2D crystals and it allows the structural investigation in a quasi-native environment. To prepare MP samples suitable for solid-state MAS NMR studies there are well established screening methods for 2D crystallisation of MPs. The paragraph 3.1 of the chapter 3 shows the labelling strategy to study the mobile part of OmpG, the expression protocol used to achieve the amount of expressed protein suitable for solid- state MAS NMR study, the refolding procedure applied and the reconstitution of the refolded labelled protein into 2D crystals at neutral and at acid pH (to characterise the mobile part of the protein responsible for the pH gating). This paragraph also describes the biophysical problem to prepare 2D crystals of labelled OmpG in acid condition and how they are finally prepared. On these 2D crystals of labelled OmpG at different pH’s solid-state MAS NMR experiments were applied to characterise the protein at different conformational states. The paragraph 3.2 describes the preparation of the second labelled OmpG NMR sample to study the region of the protein involved in the sugar binding. Here the labelling strategy, the expression protocol, the refolding procedure, the reconstitution in 2D crystals and the solid-state MAS NMR characterisation are shown. In this paragraph the expression protocol was necessarily modified to obtain enough labelled OmpG sample for structural studies because some inhibitors were used to minimise isotope dilution and an excess of AAs. The paragraph 3.3 shows how, by extending the mixing time in the pulse sequence, it is possible to obtain interresidual correlation important for the sequential assignment. Several spectra at different mixing times and different pH’s are overlapped to find out whether the chemical shift of these new peaks (the intraresidual correlations) could change at different pH’s. At the end the paragraph 3.4 describes the importance of the buffer condition to obtain a high spectrum resolution. A 2D spectrum was recorded and the signal-to-noise ratio was improved. This thesis wants to establish an approach to the preparation of different samples for NMR, particularly for studies of different regions of large MPs in their biological environment, using different selective labelling schemes for structural analysis by solid-state MAS NMR.Membranproteine stellen ein Drittel aller Proteine in den meisten Genomen dar und führen eine breite Palette von essentiellen zellulären Funktionen durch. Sie transportieren Ionen und Metaboliten für die Lipidmembranen, die die Zellen und die intrazellulären Organellen umgeben, wandeln Licht in chemische Energie um, verschmelzen die Membranen der beiden Zellen und übertragen chemische Signale über die Membran, um Zellwachstum und -teilung zu regulieren. Es ist bekannt, dass Mutationen, Fehlfaltungen und Fehlfunktionen der Membranproteine verheerende Krankheiten verursachen können. Somit sind Membranproteine von signifikanter biologischer und medizinischer Bedeutung, da sie aktuell mehr als 50 % aller Angriffspunkte von Medikamenten darstellen. Obwohl eine Reihe biophysikalischer Techniken wie Röntgenkristallographie, Elektronenmikroskopie und NMR-Spektroskopie verwendet wurden, um Membran- Protein-Strukturen zu bestimmen, sind diese Methoden nicht in der Lage, die Komplexität und Vielfalt der natürlichen Membranproteine zu replizieren. Außerdem erfordern Röntgenkristallographie und Elektronenmikroskopie stark beugende 3D- und 2D-Kristalle. Festkörper-MAS-NMR-Spektroskopie ist eine vielseitig anwendbare Methode in der Strukturbiologie und kann verwendet werden, um neue Einblicke in die Strukturen der Membrankomponenten und deren Wechselwirkungen zu liefern. Der Reichtum an für die Festkörper-MAS-NMR-Studie geeigneten Probenarten sorgt dafür, dass Daten über Proteine in einer Umgebung gesammelt werden können, die naturgetreuer und daher viel näher an einem funktionsfähigen Zustand ist. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Kennzeichnungsstrategien zur strukturellen Charakterisierung von Membranproteinen mittels Festkörper-MAS-NMR getestet. Die Bestimmung der makromolekularen Struktur durch NMR wird häufig von mehreren großen Problemen, wie der Komplexität der überfüllten Spektren, schnellen Kernrelaxationszeiten, geringer Empfindlichkeit und ungenauen Konformativen, stark behindert. Die Entwicklung der Probenbeschriftung, insbesondere mit NMR sichtbarer Isotope, ist eine der üblicherweise eingesetzten Strategien. In NMR mit großen Proteinen, die die Methoden zur Proteinproduktion erlauben, sind anspruchsvollere und elegantere Kennzeichnungsstrategien möglich. Das Ziel der Isotopenmarkierung ist es, die Empfindlichkeit und die Auflösung zu erhöhen, um die Komplexität der Spektren zu vereinfachen und die Linienbreiten einzugrenzen. Die Kennzeichnungsstrategie, welche in dieser Arbeit verwendet wird, ist die selektive Kennzeichnung. Um diese markierten Proben vorzubereiten, wurden die Kreuzkennzeichnung und Isotopenverdünnung berücksichtigt, die manchmal durch Erhöhung und Verringerung der Konzentration der entsprechenden unmarkierten Aminosäuren in den Medien als ausgleichende Wirkung reduziert werden können. Es wurde auch der Stoffwechsel der Aminosäuren in E. coli berücksichtigt. Unter Verwendung der Vorwärtsmarkierung wurden selektiv markierte OMPG-Proben hergestellt und die spektrale Überlappung im Vergleich zur Probe aus gleichmäßigen OMPG reduziert, mit dem Ziel die Anzahl der Zuordnungsmöglichkeiten zu erweitern. Die Zuordnung, die in dieser Arbeit verwendet wird, ist die intraresiduelle Zuordnung, welche die Identifizierung aller markierten Aminosäuren in einem Spin-System darstellt. Es basiert auf zweidimensionalen 13C-13C-Spektren der markierten OMPG. Die verschiedenen Typen von Kennzeichnungsstrategien werden für diverse markierte OMPG-Proben zur Verwendung in Festkörper-MAS-NMR-Studien beschrieben. Eine Voraussetzung für die NMR-Studie ist die Menge an rekombinantem Protein (mehr als 10 mg). Diese Voraussetzung ist in beiden markierten Proben erfüllt. Es wird auch beschrieben, dass schlecht gebeugte Kristalle von Proteinen der äußeren Membran G (OMPG) als Modellsystem für große Membranproteine dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit kombiniert mit Fachliteratur zeigen, dass die hoch beugenden kristallinen Materialien keine Vorbedingung für die Strukturanalyse von Membranproteinen für Festkörper-MAS-NMR darstellen. Es ist möglich, schlecht beugende 2D-Kristalle zu verwenden und es ermöglicht die strukturelle Untersuchung in einer quasi-natürlichen Umgebung. Um Membranproteinproben für Festkörper-MAS-NMR-Studien vorzubereiten gibt es etablierte Screening-Methoden für die 2D-Kristallisation von Membranproteinen. In Paragraph 3.1 des Kapitels 3 wird das Verfahren zur Vorbereitung gezeigt, welches der Bezeichnung von OMPG in rekonstituierten 2D-Kristallen bei neutralem und saurem pH-Wert dient (weil die beweglichen Teile des Proteins charakterisiert werden sollen). Besprochen werden außerdem die Probleme, auf die wir bei der Vorbereitung der markierten Probe bei saurem pH-Wert trafen, und wie wir sie überwanden. In Paragraph 3.2 wird auch die Herstellung der zweiten markierten Probe beschrieben. Hierbei geht es um die Region des Proteins in der Zucker-Bindung. Aufgrund der Verwendung von Inhibitoren zur Minimierung der Isotopenverdünnung war es schwierig, eine genügende Menge der markierten Probe für die NMR-Untersuchung zu erhalten. Das Verfahren zur Herstellung der NMR-Probe ist dasselbe wie das im Falle der dynamischen Teile des Proteins bei unterschiedlichen pH-Werten gezeigte, jedoch mit anderem Ziel. Es wird auch gezeigt (Paragraph 3.3), wie durch Verlängerung der Mischzeit in der Impulsfolge die interresiduelle Korrelation erreicht werden kann, die für die sequentielle Zuordnung wichtig ist. Hierbei werden mehrere Spektren bei unterschiedlichen Mischzeiten und verschiedenen pH-Werten übereinandergelegt, um herauszufinden, wann und ob sich die chemische Verschiebung dieser neuen Höchststände (die Intraresidualkorrelationen) bei verschiedenen pH-Werten verändern könnte. Zuletzt (Paragraph 3.4) wird die Bedeutung des Pufferzustandes beschrieben, der nötig ist, um eine hohe spektrale Auflösung zu erhalten. Ein 2D-Spektrum wurde aufgenommen und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert. Diese These will einen Ansatz zur Vorbereitung verschiedener Proben für NMR schaffen, insbesondere zur Erforschung anderer Regionen der großen Membranproteine in ihrer biologischen Umgebung unter Zuhilfenahme verschiedener selektiver Kennzeichnungs-systeme zur Strukturanalyse durch Festkörper-MAS-NMR