Transport properties of mitochondrial uncoupling proteins

HabilitationsschriftEntkopplerproteine 1 (UCP1) und 2 (UCP2) gehören zu der großen Familie mitochondrialer Aniontransporter. Das zuerst entdeckte und am meisten untersuchte Mitglied der UCP-Subfamilie - UCP1 - ist ein Transporter, der die Kopplung der mitochondrialen Respiration zur ATP-Synthese aufhebt und dadurch eine wichtige Rolle bei der zitterfreien Thermogenese im braunen Fettgewebe spielt. Im Gegensatz zu UCP1 ist UCP2 nicht in die Thermoregulation, sondern in Diabetes, Apoptose, Neurodegeneration, lipid-vermittelten oxidativen Stress u.a. involviert. Die Beteiligung von UCP2 an verschiedenen Prozessen in unterschiedlichen Organen hat bisher keine Erklärung auf molekularem Niveau gefunden. Es ist umstritten, welche Ionen durch UCP1 und UCP2 transportiert werden und wie der Transportprozess reguliert ist. Die Untersuchungen an isolierten Mitochondrien und vesikulären Membranen zeigen, dass der Protonentransport ein zentrales Ereignis in der Aktivität von UCP darstellt. Alternativen Hypothesen zufolge werden entweder die Protonen selbst (Fatty acid buffering) oder Fettsäureanionen von UCP1 (Fatty acid cycling) transportiert. Mit der Rekonstitution von gereinigten UCP1 und UCP2 in ebene Lipidmembranen wurde ein Modellsystem entwickelt, das es erlaubt, zwischen beiden Hypothesen zu unterscheiden. Wir haben demonstriert, dass die Anwesenheit von langkettigen Fettsäuren und ihre Fähigkeit zu einem spontanen Transport durch die Lipidschicht (Flip-Flop), Voraussetzungen für den UCP- vermittelten Protonentransport darstellen. Die gemesse-nen Transportraten für UCP1 (14/s) und UCP2 (4.5/s) liefern einen Hinweis auf den Transportcharakter von UCP. Die UCP-vermittelte Membranleitfähigkeit ist abhängig vom Sättigungsgrad der Fettsäuren und wächst in folgender Reihefolge: Stearinsäure, Oleinsäure, Linoneinsäure, Arachidonsäure. Diese Abhängigkeit ist ähnlich für die beiden Proteine und kann aufgrund von Fatty acid cycling -Hypothese von Skulachev, Garlid und Jezek erklärt werden. Wir haben gezeigt, dass UCP2 den FS-abhängigen Protonentransport vermittelt und somit, analog zu UCP1, als ein funktionales Entkopplerprotein fungieren kann. Die Kenntnis des Transportmechanismus und der Regulation verschiedener UCP bilden die Grundlage für ein rationales Drug-Design und ist somit wegweisend für klinische Anwendungen.Uncoupling proteins 1 (UCP1) and 2 (UCP2) belong to a large family of mitochondrial anion transporters. The first discovered and most studied member of the UCP-subfamily - UCP1 – is a carrier which uncouples mitochondrial respi¬ration from ATP-synthesis. Whereas UCP1 was shown to be responsible for the rapid production of heat in brown adipose tissue, the primary function and transport properties of ubiquitously expressed UCP2 are still controversially discussed. The most appealing hypothesis is the participation of UCP2 in the regulation of reactive oxygen species. Studies using isolated mitochondria and vesicular membranes show, that proton transport represents a main event in the UCP activity. Alternative hypotheses suggest that protons themselves (Fatty acid buffering) or fatty acid anions of UCP (Fatty acid cycling) are transported. We established a model system for reconstitution of purified UCP1 and UCP2 in planar bilayer membranes and this allowed us to distinguish between both hypotheses. We demonstrated that UCPs exhibit an increase in membrane conductivity exclusively in the presence of long chain fatty acids. The measured transport rates for UCP1 (14 s-1) and UCP2 (4.5 s-1) elucidate UCP’s carrier character. Both proteins are activated much more effectively by polyunsaturated rather than by saturated FA. The proton and total membrane conductances increased in the following order palmitic < oleic < eicosatrienoic< linoleic < retinoic < arachidonic acids. This dependence can be explained on the basis of the FA cycling hypothesis, proposed by Skulachev, Garlid and Jezek. We have shown that despite apparently different physiological functions, hUCP2 exhibited a protonophoric function similar to hUCP1 and can therefore act as a functional uncoupling protein similar to UCP1. Knowledge of transport and regulation mechanisms for different UCPs is expected to provide the basis for rational drug design, and it thus has important clinical implications