Characterization and Modulation of Claudins to Open the Blood-Brain Barrier

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) reguliert den Stoffaustausch zwischen Blut und Gehirn. Dies erschwert den Durchtritt zahlreicher Pharmaka ins ZNS und limitiert Therapiemöglichkeiten zerebraler Erkrankungen. Bisherige Behandlungstrategien basieren auf einer unspezifischen BHS-Öffnung bzw. hohen Wirkstoffdosierungen, verbunden mit starken Nebenwirkungen und eingeschränkter Effizienz. Ein Optimierungsansatz ist die transiente parazelluläre Öffnung der BHS, welche durch Gehirnkapillarendothelzellen gebildet wird. Claudine (Cldn), wesentlicher Bestandteil von Tight Junctions (TJs), dichten den Parazellularraum ab und sind daher ein vielversprechendes Drug Target. In den TJs der BHS wird hauptsächlich Cldn5 exprimiert. Des Weiteren wurden Cldn1, -3 und -12 sowie Cldn22, -24 und -25 nachgewiesen. Im Rahmen der Arbeit wurde gezeigt, dass Cldn12, Cldn22, -24 und -25 schwache, heterophile trans Interaktionen eingingen, jedoch nicht zur parazellulären Abdichtung beitrugen. Cldn3 hingegen wies in vivo eine BHS-abdichtende Wirkung auf. Der Cldn3-Knock out (Cldn3-KO) hatte im Kapillarendothel die Verringerung von Cldn1 zur Folge sowie eine erhöhte Permeabilität der BHS für kleine Moleküle. Die erhöhte Permeabilität im KO wirkte sich in ischämiegeschädigtem Hirnareal in einer im Vergleich zum Wildtyp geringeren Schwellung und Infarktgröße aus, begleitet von einer Reduktion von Occludin und Zonula Occludens-1 in den TJs. Damit ist Cldn3 als relevant für die Integrität der BHS einzustufen. Aufgrund seiner schwachen Expression ist es aber kein geeignetes Target für eine Cldn3-basierte BHS Öffnung. Der Cldn5-spezifische Modulator BO1 verringerte die Cldn5-Proteinmenge und die Permeabilität der BHS gegenüber Ladungsträgern konzentrationsabhängig und reversibel für bis zu 48 h. Dabei reduzierte BO1 über den β Catenin Pathway die Cldn5-Transkription. Unter Verwendung von 2-Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPβCD) als Lösungsvermittler wurde nach dreifacher i.v. Gabe eine permeabilitätssteigernde BO1-Wirkung in vivo erreicht. Diese Vorbehandlung ermöglichte die signifikante Wachstumsreduktion eines Glioblastoms durch das ansonsten nicht gehirngängige Zytostatikum Paclitaxel. Somit wurde BO1 als neuer Ansatz zur Verbesserung der ZNS- Gängigkeit eines Wirkstoffs nachgewiesen. Damit trägt diese Arbeit wesentlich zum besseren Verständnis der BHS-Modulation durch TJ-Regulation bei mit dem Potential zur Verbesserung der Wirkstofffreisetzung für verschiedene Erkrankungen des ZNS.The blood-brain barrier (BBB) efficiently regulates the transport of compounds between blood and brain, limiting the delivery of hydrophilic drugs into the CNS. Hence, specific treatment of cerebral diseases, e.g. glioblastoma or stroke, is severely restricted. Today therapies are based on an unspecific opening of the BBB and a high drug dosage, which is less efficient and causes adverse reactions. An optimum strategy is the transient paracellular opening of the BBB formed by endothelial cells. Their paracellular tightening is mediated by specific claudin (cldn) subtypes forming intercellular tight junctions (TJs). This makes Cldns a promising drug target. In BBB TJs, Cldn5 is the dominantly expressed protein. Yet, Cldn1, -3, -12, -22, -24 and -25 are also expressed. This dissertation shows, that Cldn12, -22, -24 and -25 formed weak, heterophilic trans-interactions. But they did not contribute to the paracellular tightening. Cldn3 had a BBB tightening function in vivo. Cldn3-knock out resulted in a reduction of Cldn1 in the brain capillary endothelial cells and an upregulated permeability of the BBB for small molecules. In the postischemic brain, this resulted in a reduced swelling and smaller infarction size compared to that of the wild type. Additionally, a reduction of occludin (Occl) and zonula occludens protein 1 (ZO-1) was shown. This proves, that even though Cldn3 is critical for the integrity of the BBB. However, due to its low expression it is not suited as target to improve drug delivery through the BBB. For Cldn5-based enhancement of the BBB permeability the Cldn5-specific small molecule BO1 was developed. It decreased concentration-dependently Cldn5 protein amount and the transendothelial electrical resistance as tightness marker of the BBB for ca. 48 h. Furthermore, it down-regulated Cldn5-transcription through a β Catenin involving pathway. Using 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) as solubility enhancer an in vivo active BO1-concentration was achieved, causing higher BBB permeability after triple i.v. injection. BO1 increased the uptake of sodium fluorescein into the brain. Moreover, it enabled a better uptake of the cytostatic agent paclitaxel, which normally does not cross the BBB, leading to a significant reduction of the gliobastoma. So, BO1 is a novel approach to transiently increase drug delivery through the BBB. Collectively, this thesis offers new insights into the modulation of the BBB via TJs and a new perspective to improve pharmacotreatment of cerebral diseases