Effect of β-lactam-antibiotic ceftriaxone in experimental stroke and its influence on astrocytic glutamate transporter GLT-1

Bei Untersuchungen in einem in vivo-Modell der amyotrophen Lateralsklerose konnte gezeigt werden, dass β-Laktam-Antibiotika und hier insbesondere Ceftriaxon neuroprotektive Effekte vermitteln können. Diese Effekte werden mit einer erhöhten Expression und Aktivität des astrozytären Glutamattransporters GLT-1 erklärt. Da die ischämisch bedingten neuronalen Schädigungen während eines Schlaganfalls unter anderem auch auf eine erhöhte Konzentration von Glutamat im Extrazellulärraum zurückzuführen sind, wurden in dieser Arbeit die potentiell neuroprotektiven Effekte von Ceftriaxon in einem in vivo-Modell des Schlaganfalls untersucht. Hierzu wurden die neurologische Situation, die Infarktgröße und die Mortalität in Ceftriaxon-behandelten und unbehandelten Tieren bestimmt. Gleichzeitig erfolgten Messungen der GLT-1-mRNA- und GLT-1 -Protein-Konzentrationen in verschiedenen Hirnarealen von Ceftriaxon- behandelten Ratten sowie in kultivierten Astrozyten der Ratte. Weiterhin erfolgten in den Astrozyten Untersuchungen des GLT-1-Promotors und der Glutamataufnahme in die Zellen. Für die in vivo-Untersuchungen wurden männliche Wistar-Ratten einer Okklusion der Arteria cerebri media (middle cerebral artery occlusion; MCAO) für 90 Minuten mit nachfolgender Reperfusion unterzogen. Die Tiere erhielten Ceftriaxon (200 mg/kg intraperitoneal) entweder einmal täglich für fünf Tage vor dem MCAO-Eingriff oder als Einmalgabe 90 Minuten nach dem MCAO-Eingriff. Die neurologische Situation wurde mittels eines 18-Punkte Scores bewertet, die Infarktgröße mittels Magnetresonanztomographie bestimmt und die Mortalitätsdaten 24 Stunden nach MCAO erhoben. Die Konzentrationen von GLT-1-mRNA und GLT-1-Protein sowohl in den Hirnregionen als auch in den kultivierten Astrozyten wurden mittels real- time-PCR und Western Blot bestimmt. Für die Promotor-Untersuchungen wurde ein Luciferase-Assay verwendet. Die Bestimmung der zellulären Glutamataufnahme erfolgte mittels radioaktiv-markierten Glutamats. Die Behandlung mit Ceftriaxon führt zu keiner signifikanten Reduktion der Infarktgröße in den Tieren mit MCAO-Eingriff. Dagegen kommt es zu einer drastischen Reduktion der Mortalität sowie zu einer signifikanten Verbesserung der neurologischen Situation bei den mit Ceftriaxon behandelten Tieren. Weder in vivo noch in vitro konnten Unterschiede im Gehalt an GLT-1-mRNA und GLT-1-Protein unter Ceftriaxon-Behandlung festgestellt werden. Im Rahmen der in vitro-Promotor- Untersuchungen, bei denen erstmals der GLT-1-Promotor der Ratte sequenziert wurde, konnten ebenfalls keine Unterschiede zwischen den Ceftriaxon- behandelten und unbehandelten Zellen festgestellt werden. In Untersuchungen zur Glutamataufnahme der Zellen zeigte sich jedoch eine Erhöhung der Transportaktivität durch eine Ceftriaxonbehandlung. Zusammenfassend konnte somit in dieser Arbeit demonstriert werden, dass Ceftriaxon auch beim ischämisch bedingten Schlaganfall neuroprotektive Effekte im Rattenmodell aufweist, welche jedoch nicht mit einer erhöhten Expression des astrozytären Glutamattransporters GLT-1 erklärt werden konnte, sondern am ehesten das Ergebnis einer Ceftriaxon-induzierten Mehraufnahme von Glutamat aus dem Extrazellulärraum sind.In experiments in an animal model of amyotrophic lateral sclerosis, it has been shown that β-lactam antibiotics and, in particular, ceftriaxone mediate neuroprotective effects. These effects have been attributed to an increased expression and activity of astrocytic glutamate transporter GLT-1. Since neuronal damage in ischemic brain areas is mediated by increased extracellular glutamate levels, this work is focused on the examination of possible neuroprotective effects of ceftriaxone in cerebral ischemia. Therefore, the effectiveness of ceftriaxone on neurological outcome, infarct size and mortality was tested in an in vivo model of cerebral ischemia. Simultaneously, the effects of ceftriaxone on expression of GLT-1-mRNA und GLT-1-Protein in different brain areas as well as in cultivated rat astrocytes were determined. Additionally, experiments concerning the GLT-1 promoter and the cellular glutamate uptake were performed. In the in vivo experiments, male normotensive Wistar rats were subjected to right middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 90 min with subsequent reperfusion. Animals received ceftriaxone (200 mg/kg bodyweight intraperitoneal once daily) either starting 5 days prior to MCAO or as a single injection 90 minutes after MCAO. Neurological evaluation was performed using an 18-point neurological scoring system. Infarct size was measured by MRT, and mortality was documented 24 hours after MCAO. Concentrations of GLT-1 mRNA and GLT-1-protein in different brain areas as well as in cultivated astrocytes were measured by real time PCR and western blotting, respectively. For promoter experiments a luciferase assay was utilized. Measurements of cellular glutamate uptake were carried out by using radiolabeled glutamate. Treatment of rats with ceftriaxone did not lead to a significant reduction of infarct size after MCAO. Nevertheless, ceftriaxone significantly improved neurological outcome and dramatically reduced mortality after ischemic brain damage. Neither in vivo nor in vitro differences in concentrations of GLT-1-mRNA und GLT-1-Protein under ceftriaxone treatment were detectable. Studies on rat GLT-1 promoter (including a first time sequencing of the promoter) did not show any ceftriaxone effects on GLT-1 promoter activity. In contrast, an increased glutamate transport activity, mediated by different concentrations of ceftriaxone, was measured by using radiolabeled glutamate in cultivated astrocytes. In summary, this work was able to demonstrate that ceftriaxone is able to act as a neuroprotektive agent in ischemic brain damage. These neuroprotective effects could not be explained by an increased expression of the astrocytic glutamate transporter GLT-1, but more likely by an increased glutamate uptake mediated by ceftriaxone