The effects of non-starch-polysaccharide hydrolyzing enzymes on nutrient metabolism and microbial metabolism products in the gastrointestinal tract of piglets

Deckblatt-Impressum persönlicher Dank Inhaltsverzeichnis Abkürzungen Einleitung Literaturübersicht Material und Methoden Statistik Ergebnisse Diskussion Schlussfolgerungen Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Danksagung SelbständigkeitserklärungGetreidereiche Diäten für Geflügel und Schweine mit hohem NSP-Gehalt werden mit Nicht-Stärke-Polysaccharid spaltenden Enzymen supplementiert, um den antinutritiven Effekt der Nicht-Stärke-Polysaccharide, die gesteigerte Digestaviskosität sowie alle damit verbundenen Folgeeffekte abzuschwächen. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Auswirkungen des Einsatzes der beiden Enzympräparate Roxazyme G2 (Multienzympräparat) und Ronozyme WX (Monoenzympräparat) der Firma DSM Nutritional Products (Grenzach-Wyhlen, Germany) im Vergleich zu einer nicht enzymsupplementierten Kontrolle zu betrachten. Das Monoenzympräparat enthält als einziges Enzym eine Endo-(1,4)-ß-Xylanase (EC-Nr.: 3.2.1.8.), welche von Thermomyces lanuginosus ssp. abgeleitet ist. Das Multienzympräparat weist drei Haupt-Enzymaktivitäten auf: Eine Endo-(1,4)-ß-Glucanase (EC 3.2.1.4.), eine Endo-(1,3-1,4)-ß-Glucanase (EC 3.2.1.6.) und eine Endo-(1,4)-ß-Xylanase (EC 3.2.1.8), welche vom Pilz Trichoderma longibrachiatum abgeleitet sind. Des weiteren soll die Hypothese, dass sich unter Einsatz NSP-spaltender Enzyme die Konzentration mikrobieller Stoffwechselprodukte und der mikrobielle Nährstoffumsatz verändert, untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden sowohl ein in-vitro Wachstumsversuch mit Digesta aus dem Gastrointestinaltrakt eines Ferkels und verschiedenen NSP-haltigen Substraten, als auch ein Fütterungsversuch mit Schweinen der Rasse EUROC (21. bis 57. Lebenstag) durchgeführt. Bei der statistischen Auswertung der Daten mit dem Computer- Programm Spss für Windows (Version 12.0) wurde einheitlich der verteilungsfreie Test nach Kruskall-Wallis angewendet, weil nicht alle erhobenen Parameter eine Normalverteilung zeigten. Als Folge-Test wurde, sofern sich Trends bzw. Signifikanzen zeigten, der Mann-Whitney-Test durchgeführt. Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p = 0,05, also 5 %, zu Grunde gelegt. Im Rahmen dieses Fütterungsversuches mit drei Gruppen (Kontrollgruppe ohne Enzymzusatz, Roxazyme-supplementierte Gruppe, Ronozyme- supplementierte Gruppe) und jeweils 20 Tieren pro Gruppe (zu gleichen Teilen männliche und weibliche) wurden zunächst über vier Wochen die üblichen Leistungsparameter wie Lebendmasse, Lebendmassezunahme, Futterverzehr, Futteraufwand und die Kotkonsistenz erhoben und anschließend, nach einem neuntägigen Abschnitt, Digesta-Proben von Magen, Jejunum und Colon zur Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit (Rohprotein, Rohfett, Rohfaser, ADF, NDF, Rohasche, Stärke und Aminosäuren) genommen. Die Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit erfolgte mittels Indikatormethode mit Chromoxid (Cr2O3) als Marker, welches der Versuchsdiät zu 0,5% zugesetzt worden war. Bei den Leistungsparametern war die Lebendmassezunahme über den Zeitraum der ersten bis vierten Versuchswoche im Vergleich zur Kontrollgruppe unter Roxazymezusatz um 6,8 % und unter Supplementation mit dem Monoenzympräparat Ronozyme um 7,1 % verbessert. Allerdings war diese Verbesserung statistisch nicht signifikant. Eine Verminderung des Futteraufwandes konnte über den Zeitraum der 1. bis 4. Versuchswoche des Fütterungsversuches bei der Monoenzympräparat-Gruppe beobachtet werden. Allerdings war dies keine statistisch signifikante Verringerung des Futteraufwandes. Die Verdaulichkeiten von Rohfaser, Rohasche, ADF, NDF und Stärke sowie die der Summe der Aminosäuren waren bei der Monoenzympräparatgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, numerisch gesehen, geringfügig erhöht. Die erwähnten Unterschiede sind, insbesondere hinsichtlich der praecaecalen Verdaulichkeit der Stärke bei den enzymsupplementierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe, aber derart gering, dass man den oft postulierten Käfigeffekt zumindest in dieser Untersuchung nicht nachvollziehen kann. Berücksichtigen muss man in diesem Zusammenhang die insgesamt sehr hohe praecaecale Verdaulichkeit der Versuchs-Diät. Dies führt dazu, dass mögliche Effekte des Enzymzusatzes hinsichtlich der praecaecalen Verdaulichkeit, im Vergleich zur Kontrollgruppe, nicht mehr deutlich erkennbar sind. Die Viskosität der Digestaproben wurde ermittelt, um eine mögliche Viskositätssenkung infolge Enzymsupplementation erkennen zu können. Die Viskosität der Jejunaldigesta war unter Zusatz des Multienzympräparates im Vergleich zur Kontrollgruppe als Trend gesenkt worden, während sie unter Gabe des Monoenzympräparates sogar signifikant erniedrigt worden war im Vergleich zur Kontrollgruppe. Beim Verdauungsabschnitt Colon war nur unter Supplementation mit dem Monoenzympräparat eine deutliche numerische Senkung der Digestaviskosität zu verzeichnen. Des weiteren wurden in den Digestaproben die bakteriellen Metaboliten Ammoniak, Lactat und die kurzkettigen Fettsäuren bestimmt und auch der Gehalt an konjugierten und dekonjugierten Gallensäuren ermittelt, um die möglicherweise unterschiedlichen Auswirkungen der beiden Enzympräparate auf die gastrointestinale Mikrobiota sichtbar machen zu können. Es sollte der Hypothese nachgegangen werden, dass sich die Konzentration bakterieller Metaboliten sowie der mikrobielle Nährstoffumsatz unter Enzymsupplementation möglicherweise ändert. Beim Vergleich der enzymsupplementierten Gruppen mit der Kontrollgruppe waren hinsichtlich der gemessenen bakteriellen Metaboliten keine statistisch signifikanten Unterschiede zu erkennen. Die Hypothese, dass sich die Konzentration mikrobieller Metaboliten und der mikrobielle Nährstoffumsatz unter Supplementation mit NSP-hydrolysierenden Enzymen verändert, fand, wenn auch nicht statistisch absicherbar, tendenziell Bestätigung. Unter anderem zeigte sich dies beim Colon in einer bei beiden Enzymgruppen numerisch erhöhten Gesamtmenge der gebildeten freien Fettsäuren als mögliches Indiz für eine gesteigerte bakterielle Fermentation. Der tendenziell senkende Effekt der Ronozymezulage auf die Dekonjugation der Gallensäuren könnte dahingehend gedeutet werden, dass der Xylanasezusatz zu Diäten für Ferkel ebenso wie beim Geflügel zur Zurückdrängung gallensäuredekonjugierender Mikroorganismen führt. Ein Agardiffusionstest mit Magen-, Jejunal- und Colondigesta diente dem Nachweis der in den jeweiligen Digestaproben vorherrschenden Enzymaktivitäten und damit dem Vergleich der den Diäten zugesetzten Enzympräparate. Hierbei stellte sich heraus, dass das Monoenzympräparat Ronozyme stabiler ist im Vergleich zum Multienzympräparat Roxazyme und es daher eher in der Lage ist, weiter distal im Verdauungstrakt seine Wirkung zu entfalten. Die größere Stabilität des Ronozymes und die damit verbundene Eigenschaft noch weiter distal im Verdauungstrakt wirken zu können, zeigt sich auch bei der Viskositätssenkung in den Colondigesta. Während das Roxazyme zu fast keiner Senkung der Viskosität in diesem diesem distalen Darmabschnitt im Vergleich zur Kontrollgruppe führt, erwirkt das Monoenzympräparat Ronozyme hingegen eine deutliche Viskositätssenkung. Die in-vitro -Studie dieser Dissertation mit Digestaproben hat gezeigt, dass intestinale Bakterien unterschiedlich auf das Vorhandensein NSP-spaltender Enzyme reagieren. Die Produktion zahlreicher NSP- Fragmente durch das Multienzympräparat aus dem (1,3-1,4)-ß-Glucan könnte das bakterielle Wachstum im Jejunum erhöhen, während die Hydrolyse des (1,4)-ß-Arabinoxylans durch die (1,4)-ß-Arabinoxylanase des Ronozymes das Bakterienwachstum in allen untersuchten Segmenten des Gastrointestinaltraktes zu hemmen scheintCorn-based diets for poultry and swine rich in NSP-content were supplemented with NSP-degrading enzymes in order to diminish the anti-nutritive effect of non-starch-polysaccharides, the increased digesta-viscosity and all subsequent related effects. The aim of this study is to investigate the consequences of using both enzyme preparations Roxazyme G2 (multienzyme-preparation) and Ronozyme WX (monoenzyme-preparation) from DSM Nutritional Products (Grenzach- Wyhlen, Germany) and to compare these to a control-group whose diet is not supplemented. The monoenzyme-preparationcontains only an endo -(1,4)-ß-xylanase activity (EC-Nr.:3.2.1.8.) derived from Thermomyces lanuginosus ssp.. The multienzyme-preparation performs three major enzyme activities: An endo -(1,4)-ß-glucanase (EC 3.2.1.4.), an endo -(1,3-1,4)-ß-glucanase (EC 3.2.1.6.) and an endo -(1,4)-ß-xylanase (EC 3.2.1.8) all of wich are derived from Trichoderma longibrachiatum. In addition, the hypothesis that the concentration of microbial metabolic products and the microbial metabolism of nutrients change with the use of NSP- degrading enzymes will be tested. To this end, an in-vitro study to estimate the growth potential of bacteria from digesta samples of the gastrointestinal tract of a piglet with different NSP-containing substrates was carried out as well as a feeding trial with weaned piglets (race EUROC aged from 21 to 57 days old). For the statistical analysis of the data, the computer program Spss for Windows (version 12.0) was used. Because of the fact that not all parameters showed a normal distribution, a Kruskal-Wallis statistical test, which is a distribution-free test, was performed. In the event that trends or any statistical significance appeared, the Mann-Whitney-test was conducted as a follow-up test. The underlying probability for error was 5 %. The feeding trial was conducted with three groups: a control-group fed a basal diet without enzyme supplementation, a Roxazyme-supplemented group and a Ronozyme- supplemented group. Each group consisted of 20 piglets (ten males and ten females). Performance parameters such as live-weight, live-weight gain, feed consumption, feed conversion ratio and consistency of faeces were recorded over a period of four weeks. Subsequently, after a period of nine days, digesta samples from the stomach, jejunum and colon were taken to determine the ilial digestibility of crude protein, crude fat, crude fibre, acid detergent fibre (ADF), neutral detergent fibre (NDF), crude ash, starch and amino acids. The ilial digestibility was determined through an indicator method using chromium oxide (Cr2O3) as a marker. The three diets were supplemented by 0,5 % chromium oxide. Evaluation of the performance parameters showed the live weight gain in the first four weeks was about 6,8 % higher in the multienzyme-enzyme-preparation group and 7,1 % higher in the mono-enzyme- supplemented group than in the control-group. However, this improvement was not statistically significant. A decrease of the feed conversion ratio in the mono-enzyme group was observed during the 1st to 4th week of the feeding trial. However, this also proved to be insignificant. In numerical terms, the digestibility of crude fibre, crude ash, ADF, NDF and starch as well as the digestibility of total amino acids of the mono-enzyme preparation group increased marginally compared to the control-group. These observed differences between the enzyme supplemented groups compared to the control group, especially the ileal digestibility of starch, were so slight that it is not possible to confirm if they were due in this case to the often postulated cage-effect . This data must also be considered in light of the very high ileal digestibility of the diet used in this study. As a result of this, possible or expected effects of enzyme supplementation on the ileal digestibility when compared to the control-group are not clearly discernible. The viscosity of digesta samples were determined in order to identify a possible decrease of viscosity resulting from the added enzymes. Compared to the control-group, the viscosity of jejunal digesta samples decreased as a trend in the group receiving a multi-supplemented diet, whereas it decreased significantly under mono-enzyme addition. The digesta samples from the colon only displayed a numerical decrease of the digesta viscosity. In addition, bacterial metabolites like ammonia, lactate and volatile fatty acids in the digesta samples were determined and the concentration of conjugated and deconjugated bile acids was ascertained in order to make the possibly different effects of both enzyme preparations on the gastrointestinal microbiota visible. The hypothesis that the concentration of microbial metabolic products as well as the microbial metabolism of nutrients is possibly changing under enzyme addition will be examined. In regard to the bacterial metabolites measured, a comparison of both enzyme supplemented groups with the control group showed no statistically significant differences. The hypothesis that the concentration of microbial metabolic products as well as the microbial metabolism of nutrients is changing with NSP-degrading enzyme supplementation, was confirmed although it was not represented statistically. This is demonstrated in the colon as a numerically increased concentration of total volatile fatty acids. This could be an indication for an increased bacterial fermentation under enzyme supplementation. The tendency that the Ronozyme supplemented diet has a decreasing effect on the deconjugation of bile acids could show that a xylanase supplement in piglet s diets leads to a restraining effect on bile acid deconjugating microbiota as it does in poultry. An agar diffusion assay with digesta samples from the stomach, jejunum and colon serves as evidence of the digesta samples predominant enzyme activities and with that a comparison of the diet s supplemental enzyme preparations. Here it emerges that the mono-enzyme preparation Ronozyme is more stable when compared to the multi-enzyme preparation Roxazyme and is therefore better able to display its effect further distal in the gastrointestinal tract. The decreased viscosity in digesta samples from colon also demonstrates Ronozyme s greater stability and associated ability to be effective in more distal parts of the gastrointestinal tract. While Roxazyme caused barely any decrease in viscosity in the distal part of the intestine when compared to the control group, the mono-enzyme preparation Ronozyme, however, caused a clear reduction in viscosity. The in-vitro study with digesta samples in this dissertation has shown that intestinal bacteria react differently to the presence of NSP-degrading enzymes. Production of multiple NSP fragments by the multienzyme preparation from the (1,3-1,4)-ß-Glucan may enhance bacterial growth in jejunum, while the hydrolysis of (1,4)-ß-arabinoxylans with the (1,4)-ß-arabinoxylanase of the Ronozyme seemed to inhibit bacteria in all tested intestinal segments