Biochemical characterization of the immune cell protein ADAP

1 Einleitung 1.1 Das Immunsystem 1.1.1 Angeborenes Immunsystem 1.1.2 Adaptives Immunsystem 1.1.3 T-Zellen 1.1.4 T-Zellaktivierung 1.1.5 Integrine 1.2 ADAP 1.2.1 Biochemische Eigenschaften von ADAP 1.2.2 Protein-Bindungspartner in T-Lymphozyten 1.2.3 ADAP in der Hämatopoese 1.2.4 Weitere biologische Funktionen 1.2.5 ADAP in anderen Zelltypen 1.2.6 ADAP-Homolog PRAM-1 1.3 Zielsetzung dieser Arbeit 2 Material und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Allgemeine Chemikalien 2.1.2 Enzyme 2.1.3 Vektoren 2.1.4 Oligonukleotide und DNA-Sequenzierungen 2.1.5 DNA-Konstrukte 2.1.6 Bakterienstämme 2.1.7 Antikörper 2.1.8 Geräte 2.2 Methoden 2.2.1 Molekularbiologische Methoden 2.2.2 Präparation und Analyse von Proteinen 2.2.3 Methoden zur Untersuchung von Proteinfunktionen in vitro 2.2.4 NMR 2.2.5 Zellkulturmethoden 3 Ergebnisse 3.1 Phosphorylierung 3.1.1 In vitro-Phosphorylierungssystem 3.1.2 Strukturelle Änderungen in phospho-hSH3C 3.1.3 Massenspektrometrische Phosphorylierungsanalyse 3.1.4 In vitro-Kinetik 3.2 Lipidbindung 3.2.1 Einfluss von Lipiden auf die Phosphorylierung 3.2.2 Einfluss der Redox- Bedingungen auf die Lipidbindung 3.2.3 Lipidbindung mit steigenden PIP2-Konzentrationen 3.2.4 Selektivität der hSH3N-Bindung an verschiedene Lipidspezies 3.3 Weitere Bindungsstudien 3.3.1 hSH3N-Interaktionspartner 3.3.2 Carma1-Bindung 3.3.3 SKAP55-Kompetition mit hSH3C 3.4 Funktionale Studien 3.4.1 Nukleäre Lokalisation 4 Diskussion 4.1 Phosphorylierung 4.1.1 Kinase- Aktivität 4.1.2 Aufreinigung von zellulärem ADAP 4.1.3 Charakterisierung der Bindung an Fyn-SH2 4.1.4 Phosphorylierung der Domänen 4.1.5 Identifizierung von Phosphorylierungsstellen außerhalb der Domänen 4.1.6 Weitere Analysen der ADAP-Phosphorylierung 4.1.7 Dephosphorylierung von ADAP 4.1.8 In vitro- Phosphorylierungskinetik 4.2 Lipidbindung 4.2.1 Lipidbindung und Phosphorylierung 4.2.2 hSH3N-Bindung unter reduzierenden und oxidierenden Bedingungen 4.2.3 Einfluss der Lipidspezies auf die hSH3N-Bindung 4.2.4 Kooperativität der PI(4,5)P2-Bindung 4.3 Weitere ADAP-Interaktionen 4.3.1 hSH3N-Interaktionspartner 4.3.2 Carma1-Bindung 4.3.3 SKAP55-ADAP-Bindung 4.4 Kernlokalisation Abkürzungsverzeichnis Zusammenfassung Abstract Literaturverzeichnis Veröffentlichungen im Zusammenhang mit dieser Arbeit DanksagungADAP (Adhesion and Degranulation promoting Adaptor Protein) moduliert in T-Lymphozyten und anderen Immunzellen die Integrin-vermittelte Adhäsion und ist an Signalwegen beteiligt, die zur Ausschüttung von Interleukin-2 führen. Das Protein enthält zwei helikal erweiterte SH3-Domänen (hSH3N und hSH3C), die mit sauren Phospholipiden interagieren können, sowie lineare Protein- Interaktionsmotive. Die durch prolinreiche Sequenzen vermittelte Wechselwirkung mit SKAP55 ist konstitutiv, während die Rekrutierung der SH2 -Domänen-enthaltenden Proteine SLP-76 und der Kinase Fyn phosphorylierungsabhängig nach T-Zell-Stimulation stattfinden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine in-vitro-Rekonstitution von ADAP-Domänen und der Fyn- Kinase erreicht, die es erlaubte neue, potenziell funktionsrelevante Tyrosinphosphorylierungsstellen mittels Massenspektrometrie zu identifizieren. Einige der durch Fyn phosphorylierbaren Tyrosine liegen innerhalb der gefalteten hSH3-Domänen und NMR-Experimente zeigten, dass es zu strukturellen Änderungen in der hSH3C-Domäne nach Phosphorylierung eines zwischen beta- Faltblatt und alpha-Helix liegenden Tyrosins kommt. In massenspektrometrischen Untersuchungen des zellulären Proteins konnte zudem die bisher unbekannte Phosphorylierungsstelle Ser558 identifiziert werden. Unter Berücksichtigung der besonderen Regulation der Src-Familien-Kinasen und der Tatsache, dass ADAP phosphorylierungsabhängig an Fyn bindet, wurde die ADAP- Phosphorylierungskinetik untersucht. Die quantitative Analyse der ADAP- Phosphorylierung durch Fyn lieferte reproduzierbare Daten, die einen vorhergesagten Feedback-Mechanismus der Kinase-Aktivität durch ADAP- Phosphorylierung unter den gewählten Bedingungen nicht bestätigen konnten. In einem zweiten experimentellen Teil dieser Arbeit wurden Bindungseigenschaften von ADAP jenseits der etablierten Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht. So konnte gezeigt werden, dass die Bindung von hSH3N an Lipidvesikel unter gleichen Bedingungen ungefähr siebenmal schwächer ist als die Bindung von hSH3C oder ADAP voller Länge. ADAP-hSH3N ändert seine Struktur in Abhängigkeit von der Redox-Umgebung. Es konnte eine Cys2-Ser2-Mutante gewonnen werden, die strukturell der reduzierten Form der hSH3N-Domäne sehr ähnlich ist. Versuche mit mutiertem und Wildtyp-hSH3N unter reduzierenden und oxidierenden Bedingungen zeigten, dass die Bindung an Lipide nicht signifikant von den Redoxbedingungen beeinflusst wird. Die Variation der Acylreste von Lipiden zeigte keinen klaren Einfluss auf die Bindung. Für hSH3C konnte demonstriert werden, dass PI(4,5)P2 nicht kooperativ bindet. Die publizierte Interaktion zwischen ADAP und Carma1 wurde im Hinblick auf die möglicherweise direkt interagierenden Protein-Domänen untersucht. Es wurden erste Hinweise gefunden, dass die Carma1-PDZ-Domäne und die ADAP-hSH3N-Domäne zentral an der für den NFkappaB-Signalweg wichtigen Protein-Komplexbildung beteiligt sind.ADAP (Adhesion and Degranulation promoting Adaptor Protein) modulates integrin-dependent adhesion in T-lymphocytes and other immune cells and is involved in signaling pathways that lead to the release of IL-2. The protein contains linear protein interaction motifs and two helically extended SH3 domains (hSH3N and hSH3C) which can interact with acidic phospholipids. The proline rich sequence-dependent interaction with SKAP55 is constitutive while the recruitment of SH2 domain containing proteins SLP-76 and kinase Fyn occurs phosphorylation dependent after stimulation of T-cells. Within this work an in vitro-reconstitution of ADAP domains and Fyn kinase was achieved which permitted identification of new, potentially functional tyrosine phosphorylation sites by mass spectrometry. Some of the Fyn-phosphorylatable tyrosines are located within the folded domains and NMR experiments showed that structural changes occur in the hSH3C domain after phosphorylation of a tyrosine that is situated between the beta-strand and the alpha-helix. In addition, mass spectrometric investigations on cellular protein identified the hitherto unknown phosphorylation site Ser558. ADAP phosphorylation kinetics were investigated considering the distinctive regulatory mechanisms of Src family kinases. Quantitative analysis of ADAP phosphorylation by Fyn yielded reproducible results that could not confirm a predicted feedback mechanism of kinase activity by ADAP phosphorylation under the chosen conditions. Binding properties of ADAP beyond the established protein-protein interactions were explored in a second experimental part of this work. It could be demonstrated that hSH3N binding to lipid vesicles is approximately seven times weaker than of hSH3C or full length ADAP under the same conditions. ADAP hSH3N changes its structure dependent on the redox environment. A Cys2-Ser2-mutant was created that closely resembles the reduced form of the hSH3N domain. Experiments with mutated and wild type hSH3N under reducing and oxidizing conditions demonstrated that lipid binding is not influenced significantly by redox conditions. Varying acyl chains of lipids did not show a clear effect on binding. It could be demonstrated for hSH3C that PI(4,5)P2 does not bind in a cooperative manner. The published interaction between ADAP and Carma1 was investigated with regard to a possibly direct interaction between protein domains. Initial evidence of a central role of Carma1 PDZ domain and ADAP hSH3N domain for formation of this important protein complex in NFkappaB signaling was found