Vaccine Adjuvants and Gene Transfer Vehicles

0\. Titelblatt, Inhaltsverzeichnis 1\. Einleitung 1 1.1 Nano- und Mikropartikuläre Arzneistoffträgersysteme 1 1.2 Feste Lipidnanopartikel 2 1.3 Ziele der Dissertation 3 2\. Material und Methoden 4 2.1 Methoden 4 2.2 Materialien 20 3\. SLN als Impstoffadjuvantien 30 3.1 Einleitung 30 3.2 SLN als Adjuvans für die Vakzinierung von Hennen 37 3.3 Untersuchungen zum Einfluß der Adjuvansmenge und Partikelgröße auf die Immunantwort am Huhnmodell 46 3.4 Ausblick 65 4\. SLN als Gentransfervehikel 66 4.1 Einleitung 66 4.2 Formulierungsentwicklung und -optimierung I 75 4.3 Formulierungsentwicklung und -optimierung II 119 4.4 Vergleich mit Liposomen 153 4.5 Weitergehende physikalische Charakterisierung 159 4.6 Steigerung der Transfektionseffiziens durch den Einsatz von Kernlokalisationssequenzen (NLS) 166 5\. Zusammenfassung 172 6\. Literaturverzeichnis 175 7\. Anhang 191 7.1 Verwendete Abkürzungen 191 7.2 Liefernachweise der Geräte und Materialien 194 7.3 Verwendete Puffersubstanzen und Lösungen 198 7.4 Publikationen und Kongreßbeiträge 200 7.5 Danksagung 202 7.6 Lebenslauf 203Der erste Teil der Arbeit handelt von Untersuchungen zum Einsatz von Festen Lipid Nanopartikeln (engl. Solid Lipid Nanoparticles, SLN) als Impfstoffadjuvatien. Zu diesem Zweck wur-den Hennen unter Zusatz von SLN immunisiert und der IgY-Antikörpertiter in den Eidottern bestimmt. Der Vorteil dieses Verfahrens lag in der unblutigen Probennahme. Der adjuvante Effekt wurde mit Freunds kompletten bzw. inkompletten Adjuvans (FCA/FIA) und mit der Vakzine ohne Adjuvans verglichen. Dabei zeigte sich, daß es durch den Zusatz von SLN zu der Vakzine zu einer charakteristischen Veränderung des zeitlichen Verlaufs der Antikörpertiterbildung kam. Dies ist ein Zeichen für eine adjuvante Wirkung. Die Gewebeverträglichkeit der SLN war sehr gut. Allerdings war die Steigerung der Antikörpertiter nur gering. Weitere Versuche sollten sich deshalb auf die Optimierung des Vakzinationsprotokolls und eventuell auf den Einsatz anderer Antigene konzentrieren. Der zweite Teil der Dissertation handelt von der Entwicklung eines SLN-Systems zur Transfektion. Basierend auf ersten Versuchen wurde am Modell der in-vitro-Transfektion von Cos-1 Zellen eine Formulierungsoptimierung durchgeführt, die zu einer sehr effizienten Formulierung mit guter Verträglichkeit geführt hat. Die Zytotoxizität wurde vom eingesetzten kationischen Lipid bestimmt. Einkettige kationische Lipide zeigten eine hohe Zytotoxizität, während zweikettige gut verträglich waren. Für die Transfektionseffizienz wurde eine Abhängigkeit sowohl vom kationischen Lipid als auch vom eingesetzten Matrixlipid gefunden. Die kationischen SLN waren sehr gut lagerstabil und ließen sich problemlos autoklavieren. Mit kationischen SLN konnten vergleichbar gute Transfektionseffizienzen wie mit Liposomen erzielt werden. Durch die Kombination mit der Kernlokalisationssequenz TAT2 konnte die Transfektionseffizienz zusätzlich noch um zwei Zehnerpotenzen gesteigert werden.The first part is dealing with investigations concerning the application of Solid Lipid Nano-particles (SLN) as a vaccine adjuvant. For this purpose we vaccinated hens under addition of SLN and determined the egg yolk concentrations of IgY. The advantage of this technique is the bloodless sample preparation. The adjuvant effect was compared to freund's complete/incomplete adjuvant (FCA/FIA) and to the vaccine without any adjuvant. The SLN induced characteristic changes of the chronological titer development. This is an indication of an adjuvant effect. The tissue tolerability was very good. Antibody titers were enhanced only slightly. Further experiments should be performed to optimise the vaccination protocol and to investigate the effect of different antigenes. The second part is about the development of cationic SLN as a new transfection agent. Based on first experiments the formulation was optimised. For this purpose an in vitro transfection model based on Cos-1 cells was employed. The optimisation lead to a very efficient formulation with good tolerability. The cationic lipids employed determined cytotoxicity: one- tailed cationic lipids showed high cytotoxicity, while two-tailed cationic lipids were well tolerated. Transfection efficiency was dependent on the cationic lipid and the matrix lipid used. Cationic SLN showed very good storage stability. Steam sterilization was possible. SLN and cationic liposomes revealed comparable transfection efficiencies. Combination of cationic SLN with the nuclear localisation signal TAT2 increased transfection efficiency hundredfold