The human c-MYC protein as target antigen for T-cells in a murine model of high grade B-cell lymphoma

Die adoptive T-Zelltherapie hat in der Behandlung von virusinduzierten Tumoren, Melanomen und B-Zelllymphomen erste Erfolge erzielt. Die entscheidende Frage hierbei ist, welches Antigen als Ziel für die eingesetzten T-Zellen genutzt werden soll. Generell sind tumorspezifische Antigene zu bevorzugen. Sie bieten die Möglichkeit einer zielgerichteten T-Zellantwort gegen den Tumor und da es sich um Neoantigene handelt, enthält das T-Zellrezeptor (TZR)-Repertoire eventuell hoch affine TZRs. Tumorspezifische Neoantigene sind durch Viren eingebrachte Proteine, durch chromosomale Translokation entstandene Fusionsproteine oder somatische Mutationen in den Tumorzellen, welche eine Änderung in der Aminosäuresequenz bewirken. Während für viele virale Antigene aufgrund ihrer hohen Immunogenität gute Chancen für eine erfolgreiche Behandlung mit T-Zellen bestehen, ist die Immunogenität von Fusionsproteinen und mutierten Selbstantigenen meist gering und von Patient zu Patient unterschiedlich. Daher werden gegenwärtig tumorassoziierte Autoantigene als Zielantigene genutzt. Das humane c-MYC Protein wird in einer Vielzahl menschlicher Tumoren überexprimiert. Es ist zudem die treibende Kraft zum Fortschreiten des Tumorwachstums und c-MYC überexprimierende Tumorenn sind von dessen andauernder Expression abhängig. Dies macht c-MYC zu einem sehr attraktiven therapeutischen Ziel in der Tumorforschung. c-MYC wird jedoch vermutlich in allen sich teilenden Zellen zumindest vorübergehend exprimiert, weswegen auch hier die Möglichkeit von Autoimmunität besteht. Um das therapeutische Potential von c-MYC als Zielantigen abzuschätzen, müssen zunächst c-MYC spezifische T-Zellen identifiziert werden. Hierzu wurde in einem ersten Schritt die Immunogenität von humanen c-MYC im H2b Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)- Kontext der Maus analysiert. Anschließend wurden verschiedene immunogene Bereiche identifiziert, welche eine T-Zellantwort induzieren. Die identifizierte CD8+ T-Zellantwort wurde mit Hilfe von Multimeren in Bezug auf Frequenz und Induktion durch Immunisierung charakterisiert. Zudem wurde analysiert, ob murine Lymphomzellen, welche das humane c-MYC Protein überexprimieren und einen Progressorphänotyp in der C57Bl/6 Maus aufweisen, durch die c-MYC spezifischen T-Zellen abgestoßen werden können. 25% der Mäuse, die mit dem Peptid immunisiert wurden, welches das MHC I-Epitop enthielt, konnten das Lymphom abstoßen, während naive, mit irrelevantem Protein immunisierte oder mit MHC II-restringierten Epitopen immunisierte Mäuse eine signifikant schlechtere Überlebenswahrscheinlichkeit aufwiesen. Durch die Nutzung von CD25+ zelldepletierenden Antikörpern vor Immunisierung erhöhte sich die Überlebensrate auf 62%. Mäuse mit höherer Frequenz Epitop spezifischer T-Zellen nach Immunisierung hatten eine höhere Überlebenswahrscheinlichkeit nach Tumorzellinokulation. Zudem zeigte sich, dass Mäuse, deren c-MYC spezifische CD8+ T-Zellen eine höhere Avidität zum Peptid-MHC-Komplex gemessen durch die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) aufwiesen, eher eine komplette Abstoßung erzielten als Mäuse mit T-Zellen von niedrigerer Avidität. Die durch die c-MYC spezifischen T-Zellen verursachten Anti-Tumoreffekte waren auch bei i.v. Injektion der Lymphomzellen und in einem adoptiven T-Zelltransfermodell nachweisbar. Zusammengefasst zeigt sich, dass durch Peptidimmunisierung eine c-MYC spezifische T-Zellantwort induziert werden kann, die auch dem Wachstum von c-MYC überexprimierenden Lymphomzellen entgegenwirkt. Zukünftige Untersuchungen werden sich auf die Optimierung dieser T-Zellen, vor allem aber auch auf die möglichen Nebenwirkungen in Form von Autoimmunität und die Übertragung dieser Antwort in den humanen MHC- Kontext konzentrieren.Adoptive T-cell therapy has shown promising results for the treatment of virally induced tumors, melanomas and B-cell lymphomas. The most important question is which antigen should be targeted by the T-cells. Tumor specific antigens are considered first choice. They provide the opportunity to target the tumor specifically without causing autoimmunity. Since they are neo antigens, the T-cell repertoire may contain T-cell receptors with high affinity. Viral proteins introduced by infection, fusion proteins originating from chromosomal translocation or somatic mutations that change the protein amino acid sequence are examples for tumor-specific antigens. Immunogenicity of viral proteins is in many cases high and allows successful treatment of virus-induced tumors with T-cells. In contrast, immunogenicity of fusion proteins and mutated self antigens is low and variable from patient to patient. Therefore, tumor associated antigens are used in most cases for adoptive T-cell therapy. They have the advantage that they are expressed in different tumors, allowing treatment of different patients with T-cells of the same specificity. Examples for tumor associated antigens are the cancer testis antigens, differentiation antigens and over-expressed antigens. The disadvantage of targeting tumor associated antigens is on one side the low immunogenicity as they represent self antigens underlying immunological tolerance, and on the other side the possible risk of autoimmunity, that affects non-tumorous tissue expressing these antigens if the tolerance is broken. The human c-MYC protein is expressed in many different tumors at high level. It is responsible for tumor growth and tumors are addicted to continuous c-MYC expression. Therefore, c-MYC is a very attractive therapeutic target for T-cell therapy. However, since c-MYC expression is also induced in dividing cells, c-MYC specific T-cells may cause autoimmunity. To investigate their therapeutic potential, c-MYC specific T-cells have to be identified. As a first approach the immunogenicity of human c-MYC has been analyzed in C57Bl/6 mice. Different immunogenic regions of the protein have been identified, which induce a T-cell response. The CD8+ T-cell response has been characterized in terms of frequency and response to immunization with the help of multimers. Additionally murine B lymphoma cells overexpressing human c-MYC were inoculated into the flanks of immunized C57Bl/6 mice. Lymphoma rejection was achieved in 25% of mice immunized with the CD8 epitope containing peptide. Naïve mice or control-immunized mice did not reject the tumor. Rejection has neither been observed with mice that have been immunized with CD4 epitope containing peptides. When CD25+ cell depleting antibodies were administered prior to immunization with the CD8 epitope containing peptide, rejection rate increased to 62%. Mice with higher frequency of c-MYC epitope-specific CD8+ T-cells after immunization exhibited a higher probability of rejection upon tumor challenge. Also T-cell avidity was a critical factor for complete rejection. Anti-tumor effects caused by c-MYC specific T-cells were also observed after i.v. injection of lymphoma cells and in an adoptive T-cell transfer model. In summary, c-MYC specific T-cells can be induced by immunization in C57Bl/6 mice. c-MYC specific T-cells inhibit the growth of c-MYC over-expressing lymphoma cells. The aim of future experiments is to optimize the efficacy of these T-cells, to investigate the possible risk of autoimmunity and to identify c-MYC specific T-cells with restriction to human MHC