Charakterisierung eines BMP-Co-Rezeptors

1 INTRODUCTION 1.1 BMP signaling 1.1.1 BMP ligands 1.1.2 BMP antagonists 1.1.3 BMP receptors 1.1.4 Structural insights on ligand and ligand/receptor complex 1.1.5 BMP receptor oligomerization 1.1.6 Smad-dependent BMP pathway 1.1.7 Smad-independent BMP pathways 1.1.8 Co-Receptors 1.2 Ror2 1.2.1 Structure 1.2.2 Animal models 1.2.3 Wnt excursus 1.2.4 Ror2 and Wnt signaling 1.2.5 Ror2 and BMP signaling 1.2.6 Ror2 in skeletal disorders 1.3 Ubiquitin-depenent protein degradation 1.3.1 Ubiquitination 1.3.2 Lysosome-dependent degradation 1.3.3 Proteasome-dependent degradation 1.3.4 Endoplasmatic reticulum- associated degradation 1.3.5 Internalization of receptor tyrosine kinases 1.4 Aim 2 MATERIALS AND REAGENTS 2.1 Commercial Products 2.2 Technical Devices 2.3 Kits 2.4 Protein Standards 2.5 Eukaryotic Expression Vectors 2.6 Eukaryotic Expression Constructs 2.7 Bacterial Strains 2.8 Cell Lines 2.9 Cell Culture Media and Reagents 2.10 Growth Factors 2.11 Inhibitors 2.12 Primary Antibodies 2.12.1 Production of anti-Ror2 323/324 antibody 2.13 Secondary Antibodies 3 METHODS 3.1 Microbiological 3.1.1 Sterilization and Disinfection 3.1.2 Bacterial Media 3.1.3 Cultivation and Conservation of E.coli Strains 3.1.4 Preparation of Heat Competent E. coli strains 3.1.5 Transformatin of Heat Competent E. coli strains 3.2 Molecular Biological 3.3 Cell Biological 3.3.1 Cultivation and Cryo Conservation of Cells 3.3.2 Determination of Cell Number 3.3.3 Transfection of Eukaryotic Cells 3.3.4 Treatment of Cells with Growth Factors and Inhibitors 3.4 Protein Biochemical 3.4.1 Preparing Cells for FACS Measurements 3.4.2 Preparation of Cell Lysates 3.4.3 Determination of Protein Content Using BCA Assay (Redinbaugh) 3.4.4 Separation of Detergent-Resistant Microdomains 3.4.5 Co-immunoprecipitation 3.4.6 SDS Polyacrylamide Gelelectrophoresis 3.4.7 Coomassie-G Staining of Proteins 3.4.8 Western Blot 3.4.9 Detection of Proteins Using Enhanced Chemiluminescence 3.4.10 Well Binding Assay 3.4.11 MALDI-TOF Mass Spectrometry 4 PRELUDE 4.1 Characterization of Ror2 interaction with Tak1 4.1.1 Tak1 interacts with full length Ror2 4.1.2 Tak1 interacts with truncated Ror2 4.2 Characterization of the Ror2/BRIb interaction 4.2.1 Interaction of Ror2 with BRIb is direct 4.2.2 Ror2 and BRIb co-fractionate in DRMs 4.2.3 Ror2 potentially disturbs the BRIb/BRII signaling complex 4.2.4 Ror2 has no effect on immediate Smad phosphorylation 4.2.5 Decreased BRIb protein levels during co-expression with Ror2 4.3 Characterization of BRIb protein loss in stable C2C12 cells 4.3.1 C2C12-BRIb cells lose surface expression of BRIb and show reduced GFP levels upon stimulation with BMP2 or GDF5 4.3.2 BRIb protein levels decrease after stimulation with GDF5 4.3.3 Loss of BRIb protein is a specific event upon initiation of the Smad-dependent signaling pathway 4.3.4 Functional consequences of BRIb protein loss 5 RESULTS 5.1 Characterization of the Ror2 receptor tyrosine kinase 5.1.1 Ror2 homodimerizes independent of ligand 5.1.2 Ror2 phosphorylation is increased in the presence of vanadate 5.2 Ror2 ubiquitination 5.2.1 Ror2 is ubiquitinated 5.2.2 Ubiquitination confirmed with HA-tagged Ror2 5.2.3 Ubiquitination of Ror2 shown with endogenous ubiquitin 5.2.4 Verification of ubiquitinated Ror2 using MALDI TOF mass spectrometry 5.2.5 Ror2 is ubiquitinated up to truncation Δ469 5.2.6 Ror2 is multiubiquitinated 5.2.7 Ubiquitinated Ror2 accumulates upon proteasome inhibition 5.2.8 Ubiquitinated protein localizes to DRM fractions in presence of Ror2 5.2.9 Ror2 interacts with ubiquitin E3 ligase Smurf1 6 DISCUSSION 6.1 Ror2 is an almost typical receptor tyrosine kinase 6.2 Evidence for ubiquitination of Ror2 6.3 Nature of Ror2 ubiquitination 6.4 Potential impact of Ror2 interaction with Smurf1 on BMP signaling 7 SUMMARY 8 ZUSAMMENFASSUNG 9 SIDE PROJECT 9.1 Monomeric and dimeric GDF-5 show equal type I receptor binding and oligomerization capability and have the same biological activity 10 REFERENCES APPENDIX Acknowledgment / Danksagung Publications Abbreviations ErklärungThe Regeneron orphan receptor 2 (Ror2) is a receptor tyrosine kinase (RTK). Since it was first described in 1992, Ror2 was found to adopt a critical role in many processes during embryogenesis and in the adult organism, including skeletal and neuronal development, cell polarity, and cell movement. In recent years Ror2 has emerged as a key player in Wnt signaling, but it was also described to have an impact on bone morphogenetic protein (BMP) signaling. The BMP family of growth factors signals through two types of transmembrane serine/threonine kinase receptors, the BMP type I receptor (BRI, i.e. BRIa or BRIb) and the BMP type II receptor (BRII). Binding of the ligand to heteromeric preformed complexes (PFC) of BRI and BRII activates Smad signaling, while binding of the ligand to its high affinity type I receptor, followed by recruitment of the type II receptor (BMP-induced signaling complex, BISC) activates MAPK pathways. The high affinity ligand for BRIb is growth and differentiation factor 5 (GDF5). Ror2 interacts with BRIb and inhibits GDF5-mediated Smad signaling. How this inhibition is achieved remains poorly understood. However, the Ror2/BRIb receptor complex is susceptible to treatment with SDS and Ror2 co-localizes with BRIb in detergent-resistant microdomains (DRMs), indicating that the complex may form in these membrane regions. RTKs such as the epidermal growth factor (EGF) receptor have been shown to dimerize and autophosphorylate upon ligand stimulation. In the inactive state the EGF receptor sits in DRMs. Upon activation through binding of the ligand the receptor transfers into clathrin-coated pits. Progression of signaling depends on receptor internalization to early endosomes. The internalization step may require ubiquitination. Ubiquitination is a post- translational modification mediated through specific ubiquitin ligases. E3 ligases are required for substrate-specific ubiquitination. The E3 ligase Smad ubiquitin regulated factor 1 (Smurf1) was described to inhibit BMP Smad signaling by ubiquitinating Smad1 and thereby targeting it for proteasome- dependent degradation. This thesis demonstrates that Ror2 is constitutively homodimerized to a large extent in the absence of external ligand stimulation and that Ror2 dimerization depends on its C-terminal tail region. Furthermore, Ror2 exhibits high tyrosine autophosphorylation capacity. These data confirm that Ror2 has characteristics of classic tyrosine kinases. Moreover, Ror2 is ubiquitinated on multiple lysines, including one or more of its five membrane- proximal lysines. Ror2 is evenly distributed across the plasma membrane and is also found in DRMs. In the presence of Ror2 an accumulation of ubiquitinated protein in DRMs could be observed, suggesting that DRM-associated Ror2 may be ubiquitinated. Data introduced in the present thesis demonstrate that the E3 ligase Smurf1 interacts with Ror2. Since immediate Smad phosphorylation is not altered in the presence of Ror2, the interaction of Ror2 with Smurf1 may possibly account for the inhibitory effect of Ror2 on Smad signaling. Future studies must reveal whether Ror2 is ubiquitinated by Smurf1 and whether the interaction of Ror2 with Smurf1 mediates ubiquitination and degradation of Smads through Smurf1, and based on which mechanisms this effect is achieved.Der Regeneron orphan receptor 2 (Ror2) ist eine Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK). Seit Ror2 im Jahr 1992 zum ersten Mal beschrieben wurde, ist klar geworden, welch zentrale Rolle Ror2 in vielen Prozessen während der Embryogenese und im adulten Organismus einnimmt. Dazu gehören seketale und neuronale Entwicklung, Zellpolarität und Zellbewegung. Zuletzt hat sich Ror2 als Schlüsselfigur in der Wnt Signalgebung herausgestellt, aber Ror2 hat auch einen Einfluss auf den bone morphogenetic protein (BMP) Signalweg. Die BMP Familie von Wachstumsfaktoren leitet Signale über zwei Typen von transmembranen Serin/Threonin Kinasen weiter, den BMP Typ I Rezeptor (BRI, d.h. BRIa oder BRIb) und den BMP Typ II Rezeptor (BRII). Bindet der Ligand einen heteromeren präformierten Komplex (PFC) von BRI und BRII, so wird die Smad Signalkaskade aktiviert, während Binden an den hoch affinen BRI, gefolgt von Rekrutieren des BRII zur Aktivierung von MAPK Signalwegen führt. Der hoch affine Ligand für BRIb ist growth and differentiation factor 5 (GDF5). Ror2 interagiert mit BRIb und inhibiert GDF5-vermittelte Smad Signalgebung. Wie diese Inhibierung erreicht wird ist weiterhin unklar. Der Ror/BRIb Rezeptorkomplex ist jedoch empfindlich gegenüber Behandlung mit SDS und Ror2 co-lokalisiert mit BRIb in Detergenz-resistenten Mikrodomänen (DRMs). Diese Daten deuten an, dass der Rezeptorkomplex möglicherweise in diesen Membranregionen gebildet wird. Für RTKs, wie zum Beispiel den epidermal growth factor (EGF) Rezeptor, ist bekannt, dass sie nach Bindung des Liganden dimerisieren und autophosphorylieren. Im inaktiven Zustand verweilt der EGF Rezeptor in DRMs. Nach Stimulation mit dem Liganden wandert der Rezeptor in clathrin-coated pits. Der weitere Verlauf des Signalwegs hängt von der Internalisierung des Rezeptors in frühe Endosomen ab. Dieser Schritt beruht möglicherweise auf Ubiquitinierung des Rezeptors. Ubiquitinierung ist eine post-translationale Modifikation, welche durch spezifische Ubiquitin.igasen vermittelt wird. E3 Ligasen werden für die Substraterkennung und spezifische Ubiquitinierung benötigt. Die E3 Ligase Smad ubiquitin regulated factor 1 (Smurf1) inhibiert den BMP Smad Signalweg, indem sie Smad1 ubiquitiniert und es somit der Proteasom-abhängigen Degradation zuführt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Großteil von Ror2 in konstitutiv dimerisierter Form vorliegt und zwar unabhängig von externer Ligandenstimulation. Weiterhin wird für die Dimerisierung die C-terminale Schwanzregion von Ror2 benötigt. Diese Daten bestätigen, dass Ror2 Merkmale von klassischen Tyrosin Kinasen besitzt. Zudem ist Ror2 an mehreren Lysinen ubiquitiniert, einschließlich einem oder mehrerer seiner fünf membranproximalen Lysine. Ror2 weist eine gleichmäßige Verteilung über die Plasmamembran auf, wobei es auch in DRMs vorliegt. In Anwesenheit von Ror2 wurde eine Akkumulierung von ubiquitiniertem Protein in DRMs beobachtet, was darauf hinweist, dass DRM-assoziiertes Ror2 ubiquitiniert sein könnte. Weitere Daten aus dieser Arbeit zeigen, das Ror2 mit Smurf1 interagiert. Da die direkte Phosohorylierung von Smads im Beisein von Ror2 nicht gestört ist, besteht die Möglichkeit, dass die Interaktion von Ror2 mit Smurf1 für die inhibierende Wirkung von Ror2 auf die Smad Signalkaskade verantwortlich ist. Weitere Studien müssen aufdecken, ob Ror2 durch Smurf1 ubiquitiniert wird und ob die Interaktion von Ror2 mit Smurf1 die Ubiquitinierung von Smads via Smurf1 vermittelt und wie genau dieser Mechanismus abläuft