Investigations of molecular pain perception mechanisms, especially biochemical characterization of the thermosensitive vanilloid receptors TRPV1 and TRPV2

> 0 TITELBLATT und INHALTVERZEICHNIS > > 1 EINLEITUNG: NOZIZEPTION UND SCHMERZ > > 1.1 Mechanismen der Nozizeption > > 1.2 Calciumkanäle und Schmerz > > 1.3 Die Familie der TRP-Kanäle > > 1.4 Thermosensitive TRP-Kanäle > > 1.5 Zielsetzung der Arbeit > > 2 ERGEBNISSE > > 2.1 Proteom-Ansatz zur Detektion schmerzregulierter Genprodukte > > 2.2 Klonierung und Charakterisierung des Vanilloid-Rezeptor 1 (VR1, TRPV1) der Ratte > > 2.3 Klonierung und Charakterisierung des Vanilloid Rezeptor-ähnlichen Proteins 1 (VRL-1, TRPV2) > > 2.4 Identifizierung von TRPV1- und TRPV2-Interaktionspartnern durch Pull- Down-Experimente > > 3 DISKUSSION > > 3.1 Proteom-Ansatz zur Identifizierung schmerzregulierter Genprodukte > > 3.2 Biochemische Charakterisierung der thermosensitiven TRP-Kanäle TRPV1 und TRPV2 > > 3.3 Ausblick auf zu untersuchende Fragestellungen > > 4 ZUSAMMENFASSUNG > > 5 SUMMARY > > 6 MATERIAL und METHODEN > > 6.1 Bakterienstämme > > 6.2 Plasmid-Vektoren > > 6.3 Reagenzien > > 6.4 Medien, Lösungen und Puffer > > 6.5 Geräte und Verbrauchsmaterialien > > 6.6 Molekularbiologische Methoden > > 6.7 Zellbiologische Methoden > > 6.8 Proteinchemische Methoden > > 7 LITERATURVERZEICHNIS > > 8 EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN > > 8.1 Originalarbeiten > > 8.2 Tagungsbeiträge > > 9 ANHANG > > 9.1 TRPV1- und TRPV2-Konstrukte > > DANKSAGUNG > >Zur Identifizierung schmerzregulierter Proteine in Schmerzmodellen wurde ein Proteom-Ansatz basierend auf der Auftrennung der Proteine durch die klassische zweidimensionale Gelelektrophorese (IEF/SDS-PAGE) sowie durch die für Membranproteine geeignete 16-BAC/SDS-PAGE in Kombination mit der MALDI- Massenspektrometrie etabliert. Für die bearbeitete Fragenstellung wurden die Grenzen dieser Methoden beschrieben. Aus dorsalen Rückenmarkhälften von Ratten (Kontrolltiere und Tiere aus Schmerzmodellen) wurde die Synaptosomenmembran- Fraktion mit dem Fokus auf membrangebundene Proteine untersucht. Der Vergleich der Proteinmuster nach 2DE lieferte zwar Differenzspots, die aber nicht reproduzierbar dargestellt werden konnten. Außerdem waren besonders integrale Membranproteine der Plasmamembran auf den IEF/SDS-2D-Gelen stark unterrepräsentiert. Mit Hilfe der gesammelten Daten konnte eine provisorische Rattenrückenmark-Proteinkarte mit über 30 Proteinen für den pH-Bereich 3-10 erstellt werden. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stand die biochemische Charakterisierung der an der Nozizeption beteiligten Rezeptoren TRPV1 und TRPV2. Die codierenden Sequenzen von Trpv1 und Trpv2 wurden in den eukaryontischen Expressionsvektor pcDNA3.1(+) inseriert. Als neuronales Expressionssystem wurde die F11-Fusionszellinie aus Hinterwurzelganglienzellen der Ratte und der Neuroblastom-Zellinie N18TG2 der Maus etabliert. Die F11-Zellen exprimieren endogen sowohl TRPV2 der Ratte als auch TRPV2 der Maus. Die Existenz beider Kanäle in derselben Zelle wurde mittels Einzelzell-RT-PCR nachgewiesen. Nach heterologer Expression von TRPV1 und TRPV2 in F11- und HEK293-Zellen konnte gezeigt werden, dass beide Kanäle eine N-Glycosylierung sowohl vom High-Mannose-Typ als auch komplexe Glycosylierung aufweisen. Die Glycosylierungsstellen wurden für TRPV1 an der Aminosäure Asn 604 und für TRPV2 an Asn 571 und 572 identifiziert. Sie befinden sich zwischen den membrandurchspannenden Helices TM5 und TM6 auf der extrazellulären Seite und bestätigen die vorgeschlagene Topologie der Kanäle, in der N- und C-Terminus cytoplasmatisch lokalisiert vorliegen. Die Glycosylierung hat keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation der Kanäle. TRPV1 und TRPV2 sind in transfizierten F11-Zellen überwiegend an der Plasmamembran und in Neuriten- artigen Ausläufern lokalisiert. In HEK293-Zellen befindet sich TRPV1 überwiegend an intrazellulären Membranen. Fehlt der cytoplasmatische N-Terminus oder ist dieser an GFP gekoppelt, so ist die Lokalisation von TRPV1 an die Plasmamembran gestört. Eine Eingrenzung der die Lokalisation determinierenden Sequenz steht noch aus. Mit Hilfe eines zweidimensionalen Systems aus Blauer Nativer PAGE und SDS-PAGE konnte der TRPV1-Signalkomplex als Homotetramer dargestellt werden. Der Komplex lässt sich aber zusätzlich bei einem höherem Molekulargewicht detektieren, was auf assoziierte Proteine hinweist. Die Identifizierung potentieller Interaktionspartner von TRPV1 und TRPV2 durch MBP-Fusionsproteine der cytoplasmatisch lokalisierten C-Termini ergab für TRPV1 bisher Aktin, für TRPV2 Aktin, ß-Tubulin und P450-(Cytochrom)-Oxidoreduktase. ß-Tubulin wurde inzwischen als direkter Interaktionspartner von TRPV1 identifiziert und verifiziert. Die Ca2+-abhängige Interaktion der beiden Proteine wurde ausführlich von C. Goswami untersucht. Weitere potentielle Interaktionspartner, identifiziert im Rahmen der Pull-Down-Experimente, werden momentan analysiert.To identify proteins that are differentially expressed in pain model systems, a proteome assay was established based on the separation of proteins by classical two-dimensional gel electrophoresis (IEF/SDS-PAGE) or by 16-BAC/SDS- PAGE, which is suitable for the separation of membrane proteins, in combination with MALDI mass spectrometry. The limits of the methods with respect to the particular question were described. Synaptosomal membranes of rat dorsal spinal cord tissue (from control and from pain-model animals) were analysed with a particular focus on membrane-bound proteins. When comparing the protein patterns after 2DE, differences on the amount of particular proteins were detectable but were not reproducible. Moreover, integral membrane proteins of the plasma membrane were strongly under-represented on 2D-IEF/SDS gels. Based on the whole data set, a provisional protein map of dorsal-horn synaptosomal membranes is provided, which comprises 30 proteins within a pH range from 3-10. The coding sequences of Trpv1 and Trpv2 were inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). As a neuronal expression system, the F11 fusion cell line of rat dorsal root ganglion cells and a mouse neuroblastoma cell line N18TG2 was established. F11 cells express both TRPV2 of rat and TRPV2 of mouse endogenously. The existence of the two channels in the same cell was shown by single-cell RT-PCR (O. Bender). After heterologous expression of TRPV1 and TRPV2 in F11 and HEK293 cells, it was demonstrated that both channels are N-glycosylated, and show high-mannose-type glycosylation as well as complex glycosylation. The glycosylation sites for TRPV1 and TRPV2 were identified as amino acid Asn 604 and as amino acids Asn 571 and Asn 572, respectively. They are located extracellularly between membrane-spanning sequences TM5 and TM6 and confirm the predicted topology of the channels with both the N- and C-terminus positioned in the cytoplasm. The glycosylation has no influence on the subcellular localization of the channels. In transfected F11 cells, TRPV1 and TRPV2 are located at the plasma membrane of the soma and of neurite-like extensions. In HEK293 cells, TRPV1 is primarily located at intracellular membranes. The localization of TRPV1 at the plasma membrane is disturbed when the cytoplasmic N-terminus is missing or when it is coupled to GFP. The determination of the plasma membrane targeting sequences is still pending. Based on its analysis by two-dimensional gel electrophoresis applying BN-PAGE as first dimension and SDS-PAGE as second dimension, TRPV1 complex forms a homotetramer. This complex shows a higher apparent molecular weight than predicted, which indicates the existence of additionally associated proteins. A search for putative interacting proteins for TRPV1 and TRPV2, which used fusion proteins of the cytoplasmic C-termini and MBP, resulted in the identification of actin for TRPV1, and of actin, ß-tubulin and P450-(cytochrome)-oxidoreductase for TRPV2. Meanwhile, ß-tubulin has been identified and verified as a direct TRPV1-interacting protein. The calcium-dependent interaction of the two proteins was analysed in detail by C. Goswami. Additional putative TRPV1-interacting proteins, identified by analysing pull-down assays, will be characterized soon