Biophysikalische und strukturelle Charakterisierung von ortspezifischer βRekombinase und ReIBE Toxin -Antitoxin Systemen

Title page 1\. Introduction 1 2\. Materials and Methods 42 3\. Site specific recombination system Streprococcus pyogenes β recombinase 61 4\. Escherichia coli RelBE toxin -antitoxin system 77 5\. Methanococcus jannaschii RelBE toxin -antitoxin system 119 6\. Outlook 136 7\. Bibliography 139 8\. Publications 153 9\. Appendices 154 Curriculum Vitae 154Recombination and plasmid maintenance are highly coordinated phenomena required for stable plasmid inheritance. To gain biophysical and structural insight in these phenomena, we tried to evaluate the properties of proteins of three important systems, namely β recombinase and the toxin antitoxin complexes RelBE from Escherichia coli and Methanococcus jannaschii. ß recombinase, a Streptococcus pyogenes pSM19035 encoded βgene product is a site-specific recombinase (23.8 kDa) that catalyzes resolution between two directly oriented recombination sites (six sites), and both resolution and DNA inversion between two inversely oriented six sites. Assembly of the synaptic complex requires binding of the βrecombinase to the six sites and the presence of Hbsu. In size exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation we observed the existence of a stable β recombinase dimer in solution. To better understand the role of ß recombinase in recombination, their unfolding mechanisms were monitored by spectropolarimetry, fluorimetry and differential scanning calorimetry. The changes in spectral and thermodynamic properties accompanying ß recombinase dimer denaturation under denaturant equilibrium were surprisingly different from the thermal melting. Measured denaturant (Gdn-HCl/urea) induced transitions unfolding curves were biphasic with a bend at 5 M urea and 2.2 M Gdn-HCl characteristic of transient intermediates. Therefore thermodynamic parameters were calculated by fitting experimental curve assuming a three-state dimer denaturation model with monomeric intermediates; this result was further supported by analytical ultracentrifugation experiments which point to molecular mass of monomers in the presence of 5 M urea. Calculated deltaG value; 17.9 kcal/mol from fits were found to be in reasonable agreement, irrespective of denaturant used either urea or Gdn-HCl for unfolding. Interestingly, thermal unfolding of dimeric βrecombinase by differential scanning calorimetry (DSC) with 4.2 microM and 18.5 microM did not reveal the formation of intermediates or different melting domains. The melting curves were characterized by symmetrical peaks and a fit directed the formation of denatured dimers in accordance with model (DF to DU). Transition temperature; Tm of 67.7 °C and calorimetric enthalphy; deltaHcal of 110 kcal/mol were measured. Therefore, we can define the unfolding of βrecombinase in terms of thermodynamic parameters (deltaG, deltaH, C½, and m), monitored secondary structure changes, molecular mass changes, and thermal melting in our experimental conditions. The Escherichia coli and Methanococcus jannaschii RelBE addiction modules play a crucial role in the cell death program that is triggered under various stress conditions. It codes for toxin RelE and the antitoxin RelB, which interferes with the lethal action of the toxin by direct protein-protein interaction. Additionally, RelE is a very efficient inhibitor of translation, both in vivo and in vitro. Furthermore RelB autoregulates transcription of relBE, and the RelB-RelE complex yields even better repression than RelB alone. Thus RelE is a co-repressor of relBE transcription. Considering cellular importance and to shed more light on the system, biophysical studies were made on the RelBE complex, RelB, and RelE from E. coli and RelBE complex from M. jannaschii. Secondary structure measurements for E. coli proteins RelB, RelE and RelBE complex monitored by circular dichroism yielded highly defined secondary structural elements in our experimental setup. This is a noteworthy point in the view of RelB in solution from the theoretical considerations and due to crystal structure data, which was published for the RelBE complex from Pyrococcus horikoshii, where an unfolded structure was suggested. The size exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation results presented in this report revealed that RelB and RelE in the lowest measured concentration range (4.8 microM RelBE in size exclusion chromatography) interact directly to form a heterodimeric complex in solution. The complex stoichometry found to be a highly concentration dependent phenomenon. In our size exclusion chromatography experiments RelBE heterodimeric and heterotetrameric complexes were observed. Analytical ultracentrifugation experiments also revealed equilibrium between RelBE heterodimeric and heterotetrameric complexes pointing to a dissociation constant roughly in microM range. RelB and RelE in solution are found to be dimeric at high concentrations, only at low concentration of 0.07 g/L equilibrium molar masses between dimer and monomer have been observed by size exclusion chromatography. Overall, these observations point towards a 1:1 ratio of RelB and RelE proteins to form a stable complex in solution. Dimerization of toxin and antitoxin were found to be a common denominator of toxin antitoxin systems. The denaturation unfolding stability curves obtained for RelB and RelE irrespective of method applied to monitor (Circuar dichroism or fluorescence spectroscopy) point towards a concentration dependent unfolding process. However, at low concentration curves direct towards presence of intermediates. With increase in protein concentration denaturant stability of dimer protein increases and leads to coupled dissociation-unfolding process. The experimental curves were fitted with the model assuming Two-state monomer and Two state dimer unfolding mechanism. Thermodynamic parameters, deltaG, C½, and m were calculated from the applied models for RelB and RelE. Unfolding studies monitoring circular dichroism showed that the antitoxin RelB has a significantly lower stability than the toxin RelE. For RelB a surprising reversibility of thermal unfolding (in DSC and CD experiments) was found, unlikely to RelE and RelBE complex which exhibited a strong aggregation tendency at temperatures of ~50 °C and showed no reversibility. A fit assuming two-state" model for folded to unfolded dimers (DF to DU) resulted in a transition temperature, Tm of 60.7 °C with an unfolding enthalpy, deltaHcal of 41.6 kcal/mol. Unfolding of RelBE complex found to be a complicated mechanism in which the unfolding atleast at high concentrations is a closely coupled dissociation-unfolding process. Under our experimental conditions, analysis of RelB, RelE and RelBE complex revealed a high stability contribution of RelE in RelBE complex. Size exclusion chromatography of RelBE complex derived from M. jannaschii pointed that complex stoichometry is a highly concentration dependent phenomenon. Denaturant induced unfolding was monitored by circular dichroism and differential scanning calorimetry. Unfolding in the presence of denaturant (Gdn-HCl) was found to be a cooperative process with protein concentration dependence. Similar to E. coli RelBE, dissociation of the complex is closely associated with the unfolding of the components. To evaluate thermal melting, excessive heat capacity curves from differential scanning calorimetry had to be measured at increasing Gdn-HCl concentrations (1.78, 2.78 and 3.85 M). Deconvolution revealed apparent values of thermodynamic parameters; enthalpy change, deltaH = 110.3 kcal/mol and melting temperature, Tm = 116 °C obtained by linear extrapolation to 0 M Gdn-HCl.Rekombination und Plasmiderhaltung sind in hohem Grade koordinierte Phänomene. Um biophysikalische und strukturelle Einblicke in diese Phänomene zu gewinnen, versuchten wir, die Eigenschaften der Proteine von drei wichtigen Systemen zu ermitteln, nämlich von ß Rekombinase und den Toxin Antitoxin-Komplexen RelBE von Escherichia coli und Methanococcus jannaschii. β Rekombinase (23,8 kDa) ist ein vom Plasmid pSM19035 aus Streptococcus pyogenes kodiertes Genprodukt. ß Rekombinase katalysiert ortsspezifisch die Trennung von Rekombinationsorten der DNA (six sites), wenn zwei solche Orte direkt orientiert sind, und sie bewirkt deren Trennung und Inversion, wenn die six sites inverse Orientierung haben. Der Aufbau des synaptischen Komplexes erfordert die Bindung der β Rekombinase an die DNA und die Gegenwart des Proteins Hbsu. Durch Gel- Permeations-Chromatographie (FPLC) und analytische Ultrazentrifugation konnten wir zeigen, daß ß Rekombinase in Lösung stabile Dimere bildet. Um das Verhalten von βRekombinase in der Rekombination besser zu verstehen, wurden einige physikochemische Eigenschaften, insbesondere ihre Denaturantien- und Hitze-induzierte Auffaltung, mittels Circulardichroismus-Messungen Fluoreszenzspektroskopie und Differenzieller Scanning-Kalorimetrie (DSC) analysiert. Die Änderungen der spektralen und thermodynamischen Eigenschaften, die die Denaturierung von Dimeren der β Rekombinase unter Denaturant- Gleichgewicht begleiten, waren überraschend verschieden vomthermischen Schmelzen. Guanidiniumchlorid- bzw. Harnstoff-induzierte Auffaltungskurven waren biphasisch mit einem Knick bei 2.2 M Guanidiniumchlorid bzw. 5 M Harnstoff und zeigten das Auftreten von transienten Zwischenstufen an. Für die Berechnung von thermodynamischen Parametern wurden die experimentellen Kurven mit einem Drei-Zustands-Modell angepasst, für das die Denaturierung von Dimeren über eine Zwischenstufe aus gefalteten Monomeren angenommen wurde. Die Ergebnisse wurden unterstützt durch Ergebnisse der analytischen Ultrazentrifugation, die in 5 M Harnstoff, am Knick der Auffaltungskurve, bereits das Vorliegen von Monomeren anzeigten. Die für Guanidiniumchlorid- und Harnstoff-Auffaltung berechneten deltaG-Werte (17.9 kcal/mol) stimmten weitgehend überein. Interessanterweise wurden für die thermische Auffaltung von dimerer βRekombinase mittels Differentieller Scanning Kalorimetrie (DSC) bei 4.2 microM und 18.5 microM keine Hinweise für das Auftreten von Zwischenstufen gefunden. Die Schmelzkurven waren durch symmetrische Peaks charakterisiert und legten die Bildung von denaturierten Dimeren gemäß (DF to DU) nahe. Übergangstemperaturen Tm (66.7 °C) und kalorimetrische Enthalpy deltaHcal (110 kcal/mol) wurden gemessen. Folglich können wir die Auffaltung von ß Rekombinase im Hinblick auf diese themodynamischen Parameter definieren, wie durch Sekundärstrukturänderungen überwacht, molekulare Masse ändert; und thermisches Schmelzen in unseren experimentellen Bedingungen. Die sog. Addiction Module RelBE von Escherichia coli und Methanococcus jannaschii spielen eine entscheidende Rolle für den programmierten Zellentod, der unter verschiedenen Stressbedingungen ausgelöst werden kann. relBE kodiert für Toxin RelE und Antitoxin RelB. Protein RelB verhindert die toxische Wirkung von Protein RelE durch direkte Protein-Protein Wechselwirkung und Bildung eines stabilen Komplexes. RelE ist in vivo und in vitro ein sehr effizienter Inhibitor der Translation. RelB autoreguliert die Transkription von relBE, wobei der RelBE-Komplex sogar eine bessere Repression aufweist als RelB allein. Damit wird das Toxin RelE zum Korepressor der relBE Transkription. In Betracht der zellularen Bedeutung und zur Erhellung seiner Eigenschaften wurden biophysikalische Studien an den Proteinen RelB, RelE und dem RelBE Komplex vom E. coli und dem RelBE-Komplex von M. jannaschii durchgeführt. Circulardichroismus-Messungen an den E. Coli Proteinen RelB, RelE und dem RelBE-Komplex, erbrachten unter unseren experimentellen Bedingungen in hohem Grade definierte strukturelle Sekundärelemente. Dieses Ergebnis ist insbesondere für RelB bemerkenswert. Für RelB in Lösung wurde aus theoretischen Erwägungen und auf Grund von Kristallstrukturdaten, die am RelBE-Komplex aus Pyrococcus horikoshii erhoben worden sind, eine entfaltete Struktur vorgeschlagen. Die mittels FPLC und analytischer Ultrazentrifugation erhaltenen Resultate zeigten, daß RelB und RelE bereits bei den niedrigsten gemessenen Konzentrationen (4.8 microM RelBE) einen heterodimeren RelBE- Komplex bilden. Die Stoichiometry des Komplexes ist ein stark konzentrationsabhängiges Phänomen. In FPLC-Experimenten wurden heterodimere und heterotetramere RelBE-Komplexe beobachtet. Auch mittels analytischer Ultrazentrifugation wurden Gleichgewichte zwischen heterodimerem RelBE und heterotetrameren Komplexen nachgewiesen, die auf eine Dissoziationskonstante in mikromolaren Bereich hinweisen. RelB und RelE in Lösung liegen bei hohen Konzentrationen als Dimere vor, nur bei niedriger Konzentration (0,07 g/l) wurden mittels FPLC für RelB molare Massen gefunden, die Gleichgewichte zwischen Dimeren und-Monomeren anzeigten. Insgesamt sprechen diese Beobachtungen für die Bildung eines stabilen RelBE-Komplexes in Lösung mit einem 1:1 Verhältnis von RelB und RelE. Die Dimerisation von Toxin und Antitoxin scheint eine allgemeineEigenschaft der Komponenten von Toxin Antitoxin-Systemen zu bilden. Unabhängig von der angewandten Analysenmethode (Circulardichroismus oder Fluoreszenzspektroskopie) zeigten die Denaturant- induzierten Auffaltungskurven von RelB und RelE einen von der Proteinkonzentration abhängigen Verlauf. Bei niedrigen Konzentrationen spricht der Verlauf der Kurven für das Auftreten von Zwischenstufen. Bei hohen Proteinkonzentrationen steigt die Stabilität der dimeren Proteine an, so daß es zu einer gekoppelten Dissoziations-Auffaltungsreaktion kommt. Die experimentellen Kurven wurden mit Modellen angepaßt, für die Two-state- Monomer- und Two-State-Dimer- Mechanismen angenommen wurden. Thermodynamische Parameter (deltaG, C½, m) wurden für RelB und RelE berechnet. Antitoxin RelB hat eine erheblich niedrigere Stabilität als Toxin RelE. Für RelB wurde eine erstaunliche Reversibilität der thermischen Auffaltung (in DSC- und CD-Experimenten) gefunden, wogegen RelE und der RelBE-Komplex bei Temperaturen von ca. 50 °C eine starke Aggregationstendenz aufwiesen und kaum Rückfaltung zeigten. Eine Anpassung der RelB-Auffaltungskurve unter Annahme eines two-state -Modells für die Auffaltung von gefalteten in entfaltete Dimere (DF to DU) ergab eine Übergangstemperatur, Tm = 60,7°C, und eine Auffaltungsenthalpy deltaHcal = 41.6 kcal/mol. Die Auffaltung des RelBE- Komplexes folgte offensichtlich einem komplizierten Mechanismus, bei dem zumindestens bei hohen Konzentrationen ein gekoppelter Dissoziations- Auffaltungs-Mechanismus zugrunde liegt. Unter unseren experimentellen Bedingungen ergab die Analyse von RelB, RelE und RelBE einen hohen Stabilitätsbeitrag von RelE im RelBE-Komplex. Die FPLC-Analyse des RelBE- Komplexes aus M. jannaschii zeigte, daß die Stoichometry des Komplexes ein in hohem Maße ein von der Konzentration abhängiges Phänomen ist. Die Denaturant- induzierte Auffaltung wurde mittels CD und DSC verfolgt. Die Auffaltung in Gegenwart von Denaturant (Guanidiniumchlorid) erwies sich als ein kooperativer Prozeß, der von der Proteinkonzentrationabhängig war. Ähnlich zu E. coli RelBE, ist die Auffaltung des Komplexes als gekoppelte Reaktion von Dissoziation des Komplexes und Auffaltung der Komponenten zu verstehen. Die hohe Thermostabilität des RelBE-Komplexes aus M. jannaschii machte Messungen in Guanidiniumchlorid-haltigen Puffern (1.78, 2.78, 3.85 M) erforderlich. Dekonvolution der experimentellen Kurven ergab nach linearer Extrapolation für 0 M Guanidiniumchlorid deltaH = 110.3 kcal/mol und Tm = 116 °C