an immunohistochemical study

Eine Möglichkeit der Behandlung von Bandscheibendegeneration in der Humanmedizin besteht in der dynamischen Stabilisierung des betroffenen Segmentes durch ein Implantat das mittels Pedikelschrauben in der Spongiosa der Wirbelkörper befestigt wird. Diese Methode wird als dynamisch bezeichnet, weil das angebrachte Implantat durch Kunststoffanteile bis zu einem gewissen Grad biegsam ist und so ein Rest Beweglichkeit des Segmentes bewahrt wird. Dieses von der Schweizer Firma Sulzer (heute ZIMMER SPINE®, Freiburg, Deutschland) entwickelte System trägt den Namen Dynesys (Dynamic Neutralization System). Auf der gleichen Basis entwickelte die Firma SYNTHES® (Solothurn, Schweiz) ein hier getestetes System (SoFi). Ziel der vorliegenden Studie war es, die Effektivität des dynamischen Implantats als Therapie gegen die Degeneration der Bandscheiben an einem ovinen Degenerationsmodell, mittels immunhistochemischer Methoden, zu untersuchen und statistisch zu beurteilen. Die Hypothese der Studie besagte, dass das experimentelle, posteriore, dynamische Implantat in der Lage ist, die durch eine partielle Nukleotomie zugefügte Degeneration zu stoppen, oder sogar umzukehren und regenerative Prozesse einzuleiten. Dafür wurden 40 weibliche Merinolandschafe in vier Gruppen eingeteilt. Alle Tiere wurden einer partiellen Nukleotomie unterzogen, welche die Bandscheibendegeneration simulieren und herbeiführen sollte. Zwanzig Tiere bekamen dazu durch einen weiteren chirurgischen Eingriff das experimentelle, dynamische System implantiert. Die Hälfte dieser zwanzig Tiere wurde nach 3 Monaten (3-Monate-Implantat-Gruppe), die andere Hälfte nach 12 Monaten (12-Monate-Implantat-Gruppe) euthanasiert und ihre Bandscheiben zwischen den Lendenwirbelkörpern L3 und L4 immunhistochemisch untersucht. Die restlichen 20 Tiere, die kein Implantat bekamen, wurden analog nach 3 (3 -Monate-Läsion-Gruppe) beziehungsweise 12 Monaten (12-Monate-Läsion-Gruppe) eingeschläfert und ihre Bandscheiben in gleicher Art und Weise untersucht, um den Vergleich zu den Implantat-Gruppen herstellen zu können. Fünf Tiere gingen aufgrund von Narkosezwischenfällen verloren. Weitere Probenverluste kamen bei der Vorbereitung der zu untersuchenden Proben zustande, so dass am Ende für jede Analyse zwischen 5 und 9 Proben zur Verfügung standen. Um den Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen herstellen zu können, wurde an den Proben eine immunhistochemische Markierung von α-SMA, Keratansulfat, MMP 13, PGP 9.5 und den Kollagentypen I und II durchgeführt. Die immunhistochemisch markierten Proben wurden als digitale Bilder erfasst und eine Pixelanalyse durchgeführt. Die durch die Pixelanalyse gewonnenen Daten wurden statistisch analysiert. Die Daten der verschiedenen Gruppen wurden miteinander verglichen und anschließend durch die statistischen Tests das Signifikanzniveau ermittelt. Die Immunlokalisation von α-SMA lieferte bei den 3-Monate-Gruppen kein eindeutiges Ergebnis, da sowohl Indizien für eine Regenerationstendenz bei der Implantat- Gruppe als auch Anzeichen eines gleich hohen Degenerationsgrades beider Behandlungsgruppen zu erkennen waren. Die 12-Monate-Gruppen zeigten dagegen ein Ergebnis, welches eindeutig für eine Regenerationstendenz der Implantat- Gruppe sprach. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Untersuchung auf die Neoinnervation festgestellt. Auch die Metalloproteinasenaktivität war bei der Implantat-Gruppe nach 12 Monaten niedriger als bei der Läsion-Gruppe, dennoch waren die Werte höher als nach 3 Monaten, weshalb man in diesem Falle nicht von Regeneration sprechen kann. Diese Untersuchungen zeigten nach 3 Monaten entweder nicht beurteilbare Ergebnisse, oder Hinweise für eine Verschlechterung bzw. keine Veränderung der Degeneration bei beiden Behandlungsgruppen. Dessen ungeachtet zeigten die 12-Monate-Gruppen Hinweise einer Regeneration und unterstützten damit die These der Studie. Die Immunlokalisierung von Keratansulfat war bei vergleichbaren Gruppen ähnlich und zeigte damit keinen Hinweis auf eine regenerative Wirkung des Implantates. Die Hauptkollagenarten Kollagen Typ I und Typ II wurden ebenfalls auf ihr Vorkommen und auf das Verhältnis zueinander in den Übergangszonen untersucht. Kollagen Typ I zeigte nach 3 Monaten eine niedrigere Streuung der Werte bei der Implantat-Gruppe, als Zeichen eines niedrigeren Degenerationsgrades als die Läsion-Gruppe. Die Verteilung von Kollagen Typ I innerhalb der Gruppen selbst zeigte jedoch höhere Ansammlungen an Kollagen Typ I in der Nucleus-Zone der Implantat-Gruppe, was wiederum Hinweise für einen höheren Degenerationsgrad liefert. Nach 12 Monaten zeigte aber die Implantat-Gruppe sowohl die niedrigere Streuung der Werte, als auch die physiologischere Verteilung von Kollagen Typ I innerhalb der Bandscheibe, was auf einen niedrigeren Degenerationsgrad zurückgeführt werden kann. Die Untersuchung auf Kollagen Typ II gab als einzige schon nach 3 Monaten Indizien von Regeneration bei der Implantat-Gruppe, sowohl bei der Untersuchung der Gesamtflächen, als auch der einzelnen Zonen und bei der Untersuchung der Endplatten. Diese Resultate wurden auch bei der Mehrzahl der RoIs von den statistischen Tests bestätigt. Nach 12 Monaten lagen aber die Streuungen beider Behandlungsgruppen in diesen drei Analysen auf gleicher Höhe und zeigten somit Hinweise für einen vergleichbar hohen Degenerationsgrad bei beiden Behandlungsgruppen. Der Vergleich beider Kollagentypen in den Übergangszonen zeigte Hinweise für Regeneration der Bandscheiben der Implantat-Gruppen. Allerdings wurde nach 12 Monaten nur bei den rechten Übergangszonen diese regenerative Wirkung des Implantats verzeichnet. Die vorliegende Studie zeigte bei der Mehrzahl der Untersuchungen Ergebnisse, die auf eine positive Wirkung des experimentellen Implantats SoFi gegen die Degeneration der Bandscheiben hindeuten. Die aus der Sicht der Patienten wichtigsten Parameter sind mit großer Wahrscheinlichkeit die Neoinnervation, welche Studien zufolge in Verbindung mit Schmerzen stehen kann und die auch mit der Neoinnervation einhergehende Angiogenese. Diese beiden Parameter, die anhand der Immunlokalisierung von PGP 9.5 und von α-SMA untersucht wurden, zeigten befriedigende Resultate bei den 12-Monate-Gruppen, obwohl sie bei den 3-Monate-Gruppen unbefriedigend waren. Aus der Sicht des Therapeuten zählen zu den wichtigsten Parametern, zusätzlich zu den eben erwähnten Kriterien, das Verhältnis und die Verteilung der Hauptkollagentypen I und II in der Bandscheibe. Dieser Parameter gibt Rückschluss darüber, wie sehr die Bandscheibe noch in der Lage ist, ihre Aufgabe zu erfüllen, da diese beiden Moleküle für die Druck- und Zugfestigkeit der Bandscheibe hauptverantwortlich sind. Die Analyse von Kollagen Typ I und II in den Übergangszonen ergab bei nur einer von vier Untersuchungen keine Verbesserung der Degeneration bei der Implantat-Gruppe. Alles in allem wurde bei der Mehrheit der untersuchten Punkte eine regenerative oder zumindest Degeneration-verlangsamende Wirkung des dynamischen Implantates auf die Degeneration verzeichnet. Diese Ergebnisse wurden aber nur in 2 Fällen (MMP 13 und Kollagen Typ II) durch die statistischen Tests für signifikant befunden. Somit bleiben die große Mehrheit der Ergebnisse dieser Studie auf die deskriptive Ebene beschränkt und kann nur bedingt auf andere Tiergruppen übertragen werden.The dynamic stabilization of a degenerated intervertebral disc is an established method for the treatment of lower back pain in human medicine. This concept consists of an implant attached to the anterior and posterior vertebral body of the damaged intervertebral disc by pedicle screws. The implant contains a soft articular region between two rigid elements allowing the stabilized segment to maintain certain motility which preserves the adjacent intervertebral discs from a fast degeneration. This system is called Dynesys and was developed by the former Swiss company Sulzer which is nowadays part of ZIMMER SPINE®. SYNTHES® developed the SoFi-System using the same principle and combining it with the ClickX-system developed by the same company. The objective of this in vivo study was to evaluate the effectiveness of the experimental posterior dynamic stabilization system called SoFi (SYNTHES, Solothurn, Switzerland) as therapy against intervertebral disc degeneration in an ovine degeneration model using immunohistochemical analysis. This posterior dynamic system was developed following the same idea behind the Dynesys system. The hypothesis of this study indicates that this experimental posterior dynamic stabilization system is capable of stopping or even revert the intervertebral disc degeneration in this ovine degeneration model. Forty sheep underwent a partial nucleotomy surgery at the intervertebral disc segment L3-L4 simulating an anulus tear. The animals were distributed into four groups. Two of the four groups received additionally the posterior implant on the same segment as the partial nucleotomy. Two groups (one with and one without implant) were euthanized three months after surgery and their spines were extracted to be analyzed by immunohistochemistry. The other two groups were euthanized twelve months after the surgery and underwent the same procedure. The parameters used to evaluate the degeneration in the intervertebral discs were the immunostaining for α-SMA, Keratan sulfate, MMP 13, PGP 9.5, Collagen type I and Collagen type II and the ratio of both collagen types in the transition zone. After dissection, the L3-L4 segments of the spines were cut with a microtome into 4 µm thick samples which passed through immunohistochemical staining. The samples were recorded as digital images, and pixel analysis was performed to obtain the size of the stained area as a result. The obtained data was analyzed using descriptive statistics to make a comparison between the groups. After that, the significance level of the difference between the two coeval groups was accessed to determine the quality of the information obtained from the comparison. The disposition for angiogenesis was analyzed using an antibody against α-Smooth Muscle Actin (α-SMA). Due to the fact that both 3-month groups showed evidence for a higher degeneration level, it was not possible to determine whether the implant worked as expected or not. In the other hand, the 12-month-implant group showed smaller levels of immunopositivity against α-SMA, indicating a lower grade of degeneration in these animals confirming the effectivity of the implant. The same result was obtained from the analysis for the metalloproteinase activity (MMP 13) and the neoinnervation (PGP 9.5) of the intervertebral disc. Both of these parameters showed no difference between both treatment groups after 3 months, but regeneration signs in the implant group after 12 months. The immunostaining for Keratan sulfate was the only parameter not showing any regeneration signals in the implant group at any time. The main Collagen types of the intervertebral disc matrix Collagen Type I and Type II were also analyzed, as well as their ratio towards each other in the transition zone between the anulus fibrosus and the nucleus pulposus of the intervertebral disc. The two criteria used to gather the information about the degeneration level using Collagen Type I as reference were the variance of the results and the distribution of the immunopositive areas inside the intervertebral disc, meaning bigger collagen I areas in the nucleus pulpous a higher degeneration level. Collagen Type I delivered an ambiguous result at the 3-month groups, showing signs for a higher as well as for a lower degeneration level in the implant group. After 12 months however, the results revealed evidence of lower degeneration levels on the implant group and showed a satisfactory effect of the implant. The immunostaining for collagen type II revealed at each one of the analysis signs of a regenerative effect of the implant on the disc for the 3-month-groups. These analyses consisted of the immunopositive areas of the whole intervertebral disc, of the zones and of the cartilage endplate. These results were also confirmed by the statistical tests in the whole upper cartilage endplate, the left annulus fibrous and the central nucleus pulpous RoIs. Both 12-month groups showed very similar results though, indicating that the degeneration level was comparable in both groups. The comparison of the presence of both Collagen types in the transition zones revealed lower degeneration signs for the implant group at both sides 3 months after surgery. After 12 months however, only the right side delivered a similar result, whereas the left side (injury side) showed higher amounts of collagen type I than type II pointing out a higher degeneration level. The experimental SoFi implant delivered satisfactory results on most of the analyzed parameters of this study. From the patients point of view, the pain is surely the most important parameter for measuring the effectiveness of an intervertebral disc degeneration therapy method. According to the literature, there is a relation between neoinnervation occurrence in the intervertebral disc and the lower back pain. The neoinnervation and the mostly with it associated neoangiogenesis showed a lower degeneration ratio in the implant- groups 12 months after the surgery, even though the results varied between failure of the implant and undetermined 3 months after the surgery. From the therapist’s point of view, the collagen ratio is surely one of the most important parameters in addition to the others previously mentioned. Collagen type I and type II are the main responsible for the elasticity and pressure resistance of the intervertebral disc. This means that the analysis of these molecules delivers information on the task fulfilling capability of the intervertebral disc. Only one of four results of this comparison didnt show a satisfactory effect of the implant against degeneration. Longer term studies are necessary to better assess the effectiveness of this novel implant, in order to better survey the evolution of these analyzed parameters of disc degeneration. Hereby it would be possible to monitor the processes that take place during tissue healing and separate them from those indicating the degeneration. The angiogenesis delivers an example. Three months after surgery it could be possible to find higher angiogenesis in a tissue that has been more effectively repaired, whereas after one year angiogenesis associated with neoinnervation represents a clear sign of tissue degeneration. To completely assess the benefits of using this novel implant, the adjacent segments should also be analyzed in the same way. Hereby it would be possible to evaluate whether this implant really prevents the adjacent segments from degenerating in the way fusion does, or not. To summarize the results of this study, evidence for a lower degeneration ratio could be registered at most of the test parameters confirming the effectiveness of the implant. However only 2 of them (MMP 13 and Collagen Type II) could be statistically confirmed as significant. Therefore these results are to be considered as descriptive and not to be assigned for other animal populations than the ones used for this experiment