Kooperation zwischen Toll-like Rezeptoren und Sphingosin 1-phosphat in Keratinozyten

Keratinocytes are essential structural components of the epidermis that also have a surveillance role in epidermal immunity. As nonprofessional immune cells they have the ability to quickly and efficiently respond to pathogens and are part of the first-line innate immune defense. Their reaction upon exposure to pathogens or any other damage of the epidermal barrier results in a strong inflammatory response which activates signaling cascades to restore the intact barrier and protect the host from severe damage. Pathogen- associated molecular patterns (PAMPs) are specific parts of microbes that serve as a critical alert for keratinocytes by binding to pathogen recognition receptors (PRRs). These receptors are specifically expressed throughout cell types which enables efficient screening and defense against harmful infections. Toll-like receptors (TLRs) are the most characterised group of PPRs found on the cell surface (TLR1,2,4,5-6) and intracellular compartments (TLR3 and 9) in keratinocytes. PAMP binding to TLRs causes a change in receptor confirmation and activation of downstream signaling cascades by triggering nuclear factor kappa B (NF-κB) or interferon regulatory factor (IRF), which both result in an abundant release of pro-inflammatory molecules. TLR function in keratinocytes has previously been investigated, but their contribution to epidermal homeostasis is not yet fully understood. Accordingly, the present thesis aimed to elucidate involvement of TLRs in the regulation of epidermal homeostasis by the use of specific TLR agonists and analyzis of cell growth, differentiation and inflammation. Functionality of TLR2, 3 and 9 in keratinocytes was confirmed by enhanced release of pro- inflammatory molecules CXCL-8, IL-1α and TNF upon selective exposure of keratinocytes to TLR agonists. It could further be confirmed that TLR9 is responsible for innate immune responses to bacterial DNA in keratinocytes. Furthermore, the impact of longer, 24-mer, oligonucleotides CpG- and its control GpC-ODN with a phosphorotio-backbone (PS-ODN) was investigated in normal human keratinocytes (NHK) and epithelial cell lines HaCaT, SCC-12 and SCC-25. The stimulation of epidermal cells with TLR9 ligands resulted in remarkable production and upregulation of pro-inflammatory cytokines (CXCL-8, IL-1α and TNF-α). In addition, when keratinocytes were pre-treated with an inhibitor of endosomal acidification chloroquine, CXCL8 production was abrogated. The same effect was revealed after TLR9 knockdown, confirming TLR9-dependent cytokine induction. Here, it is also shown that TLR stimulation did not significantly impair normal keratinocytes but led to the modulation of cellular growth processes in hyperproliferative and malignant keratinocytes. Interestingly, CpG- and GpC-ODN had only minor growth inhibitory effects against normal keratinocytes and SCC-12, but almost completely inhibited cell growth in HaCaT and SCC-25 cell lines, and this effect could not be abrogated by chloroquine, which points to TLR9-independent effects. CpG-ODN stimulated keratinocytes also responded with upregulation of hBD-1 and 3, whereas no expression and upregulation could be observed in malignant cell lines. Taken together, skin epithelial cells recognize and respond to PS-ODNs and can actively contribute to innate immune responses and inhibition of hyperproliferative activity. Whilst anti-proliferative effects of PS-ODNs were TLR9-independent, it could be confirmed that TLR9 regulates differentiation processes of keratinocytes. Hence, TLR9 silencing leads to remarkable upregulation of differentiation markers. The results here indicate that interaction of keratinocytes with pathogens occurs on multiple levels, which could be linked to resistance mechanisms of epidermis against infections. It has been well documented that sphingosine-1-phosphate (S1P) is an important bioactive molecule that exerts its effects by binding to its receptor subtypes. Here, it is shown that S1P induces pro-inflammatory responses in keratinocytes by releasing CXCL8 and IL-6 independently of the receptor subtypes S1PR1-3 since specific S1PR antagonists could not abrogate cytokine release. Moreover, S1P reduced proliferation of normal keratinocytes, wherease increased the proliferation of hyperproliferative cell line HaCaT. In addition, a potential crosstalk of S1P and TLR signalling in epidermal inflammation was evaluated. Addition of S1P clearly intensified pro- inflammatory TRL signalling in keratinocytes, in particular intracellular TLR3 and 9 activation. Moreover, enhanced production of pro-inflammatory molecules was S1PR1-3-independent. Of interest, presented results show evidence for synergistic interaction between TLR and S1P in keratinocytes, which was observed in high IL-6 and also decreased total STAT3 release. As deregulated STAT3 activity is common in malignant processes, is this observation of interest for TLR9 agonist CpG-ODN, which impaired the growth of squamous carcinoma cell lines. Currently, limited amount of data is available about TLR modulation of S1P levels. The expression of SPP1 and S1PL was induced by TLR3 agonist Poly(A:U) and TLR9 Agonist ODN2006. This induction of S1P degrading enzymes was in correlation with slight intracellular decrease of S1P and increase of Sph. Furthermore, after inhibition of anabolic SphK altered CXCL8 levels were observed only with TLR2 agonist HKLM, whereas no difference in release could be seen in case of Poly(A:U) and CpG-ODN. On the contrary, the inhibition of S1PL enhanced TLR3 and TLR9-mediated pro-inflammatory response, which was also demonstrated by S1PL-knockdown results. This supports the proposed action of S1P as the enhancer of epidermal immunity and its preferable collaboration with intracellular TLRs. In the first part of this work an involvement of TLR9 in differentiation of keratinocytes was revealed. In this agreement, the crosstalk of S1PL and TLR9 signalling was further investigated in this regard. The inhibition and knockdown of S1PL before TLR9 led to enhanced CXCL8 release and simultaneously increased expression of epidermal differentiation markers KRT10, IVL and FLG, both typical for the most outer epidermal layer stratum corneum. This presents a previously unknown role of S1PL in mediation of TLR9 signalling upon bacterial encounter, where S1PL most probably contributes to surveillance of epidermal TLR9 signalling. Taken together, this work confirmed the cooperation of TLR and S1P in regulation of epidermal inflammatory and differentiation processes. The strategic position of TLR, S1P and S1P metabolizing enzymes enables their collaboration in order to assure a proper response by keratinocytes against pathogens.Die Keratinozyten sind essenzielle Bestandteile der Epidermis, die auch eine Überwachungsrolle in der epidermalen Immunfunktion spielen. Auch als untypische Immunzellen sind sie in der Lage, schnell und effizient auf die Pathogene zu antworten und bilden damit einen Teil der ersten Reihe der angeborenen epidermalen Immunabwehr. Nach Enttarnung durch die Pathogene oder einen anderen Schaden der epidermalen Barriere reagieren die Keratinozyten mit einer verstärkten Entzündungsreaktion, die darüber hinaus eine Signalkaskade aktiviert, um die Barriere schnellstmöglich zu reparieren und den Wirt vor größeren Schäden zu schützen. Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen (PAMPs) sind spezifische Teile der Mikroben, die nach der Bindung an die Pathogenstruktur-Erkennungsrezeptoren (PRRs) eine kritische Warnung für die Keratinozyten darstellen. Diese Rezeptoren sind gezielt in den verschiedenen Zelltypen exprimiert, was einer effizienten Früherkennung und Abwehr von gefährlichen Infektionen dient. Die Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind die meist erforschte Gruppe der PRRs und sind in den Keratinozyten an der Zelloberfläche (TLR1,2,4,5,6) und in den intrazellulären Kompartimenten (TLR 3,9) zu finden. Die PAMP-Bindung an die TLRs verursacht eine Änderung der Rezeptorkonfirmation und aktiviert dadurch die zellulären Signalkaskaden, wodurch eine reichliche Freisetzung der pro-inflammatorischen Moleküle wie CXCL8 und IL-6 gefördert wird. Die TLR Funktionalität in den Keratinozyten wurde bereits bestätigt, jedoch ist ihre Bedeutung in der epidermalen Homöostase noch nicht vollständig bekannt. Demzufolge wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der spezifischen TLR Agonisten die Beteiligung der TLR an der Entzündungsregulierung, dem Zellwachstum und der Zelldifferenzierung in normalen und modifizierten Keratinozyten untersucht. Die Aktivierung von TLR 2,3 und 9 erhöht die Freisetzung der CXL8, IL-1α und TNF. Des Weiteren konnte die TLR9-abhängige pro-inflammatorische Wirkung bestätigt werden. Zudem wurde der Effekt der längeren (24mer) Oligonukleotiden CpG und deren Kontrolle GpC, die eine Phosphothio-Bindung enthalten (PS-ODN), in den normalen humanen Keratinozyten und epithelischen Zelllinien HaCaT, SCC-12 und SCC-25 untersucht. Alle Zelltypen reagierten mit einer erhöhten Expression und Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine (CXCL8, IL-1α und TNF). Interessanterweise hat die Blockade des TLR9 durch Chloroquine und siRNA Knockdown des TLR9 die CXCL8 Freisetzung reduziert. Dies deutet darauf hin, dass die pro-inflammatorische Wirkung der CpG-und GpC-ODN TLR9-abhängig ist. Es wurde auch gezeigt, dass CpG- und GpC-ODN keinen Einfluss auf die Zellviabilität der normalen Keratinozyten haben, wohingegen sie aber die Viabilität und das Wachstum der modifizierten und malignen Keratinozyten beeinflussten. Somit wurde dieser anti-proliferative Effekt am stärksten bei den HaCaT und SCC-25 Zellen beobachtet, welche nicht mittels Chloroquine Blockade unterbrochen wurden, was auf eine TLR9-unabhängige Wirkung hindeutet. Dahingegen wurden die Differenzierungsmarker nach der Stimulation mit CpG- und GpC-ODN erhöht, die nach siRNA Knockdown des TLR9 noch stärker induziert wurden, was eine aktive TLR9-Beteiligung an den epidermalen Differenzierungsprozessen aufzeigt. Zusammengefasst geben diese Ergebnisse erste Hinweise auf ein multi-level Zusammenspiel zwischen Keratinozyten und Pathogenen, das in Verbindung mit einem Resistenzmechanismus der Epidermis gegen Infektionen stehen könnte und dienen als Anhaltspunkt für weitere Studien in dieser Richtung. Sphingosine 1-phosphate (S1P) ist ein wichtiges bioaktives Molekül, das seine Wirkung maßgeblich über seine Rezeptoren (S1PR) vermittelt. Die hier erstmals gezeigte pro-inflammatorische Wirkung des S1P in Keratinozyten konnte nicht mittels S1PR1-3 Antagonisten reduziert werden. Darüber hinaus wurde hier ein abweichender S1P Einfluss auf die Zellproliferation untersucht. So konnte eine bereits bekannte antiproliferative Wirkung des S1P in Keratinozyten bestätigt werden, wohingegen bei den modifizierten Hautzellen eine Tendenz zu beschleunigter Proliferation zu beobachten war. Die Kombination der TLR 2,3 und 9 Agonisten mit S1P verstärkt die pro-inflammatorische Signalisierung der TLR, insbesondere des TLR3 und TLR9. Eine S1PR1-3 Beteiligung konnte nicht bestätigt werden. Zudem deuten die Ergebnisse auf eine synergetische Wirkung zwischen TLR, S1P und wahrscheinlich STAT3 Signalisierung hin, da ein Anstieg der IL-6 Menge parallel zur reduzierten gesamten STAT3 Freisetzung aufgezeigt werden konnte. Die SPP1 und S1PL Expression wurde durch TLR3 Agonisten Poly(A:U) und TLR9 Agonisten CpG-ODN induziert. Diese Erhöhung der S1P- Abbauenzyme stand in Zusammenhang mit der leichten Senkung der intrazellulären S1P und einem Anstieg der SpH Menge. Des Weiteren wurde die CXCL8 Sekretion nach der SphK Inhibition nur in TLR2-stimulierten normalen Keratinozyten verändert, wohingegen die in TLR3 und TLR9-stimulierten Keratinozyten unverändert blieben. Hingegen wurde die CXCL8 Freisetzung nach der S1PL Inhibition mittels 4-DPH in TLR3 und TLR9-stimulierten Keratinozyten deutlich erhöht. Dies weist auf ein bevorzugtes Zusammenspiel des S1P mit den intrazellulären TLR hin. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die S1PL Beteiligung in der TLR9-vermittelten Differenzierung der Keratinozyten untersucht. Die S1PL-Inhibition und siRNA Knockdown der TLR9-stimulierten Keratinozyten führten zu einer verstärkten Expression der Differenzierungsmarker IVL und FLG unter gleichzeitig erhöhter CXCL8 Freisetzung. Die erzielten Ergebnisse legen eine bis dato unbekannte Funktion des S1PL in den TLR9 Signalwegen dar und geben einen Hinweis auf eine Überwachungsrolle in der epidermalen Immunabwehr. Zusammengefasst bestätigte diese Arbeit die Zusammenarbeit der TLR und S1P in der Regulierung der inflammatorischen Signalwege und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten. Die vermeintlich strategische Position der TLR, S1P und S1P-metabolisierenden Enzyme ermöglicht eine effektive Immunantwort auf die Pathogene