Development of an in vitro method for assessing the photosensitive potential of pharmaceutical drugs

Das Ziel dieser Arbeit, dass photochemische Verhalten von Arzneistoffen gegenüber Licht und das damit verbundene photosensibilisierende Potential mittels instrumenteller Methoden ein-zuschätzen, wurde erfolgreich erreicht. Dies geschah mit Hilfe der Weiterentwicklung einer bestehenden HPLC-Methode. So ist es jetzt möglich die Bildung von ROS bei der online Bestrahlung von Arzneistoffen mittels ver-schiedener Surrogat-Parameter zu detektieren und eine Kinetik zu erstellen. Die Bildung von Singulett-Sauerstoff unter Lichteinfluss wurde mit Hilfe von FFA und RNO an verschiedenen Arzneistoffen untersucht, dabei zeigten Ketoprofen, Furosemid und Doxycyclin die stärksten 1O2-Bildungen. Darüber hinaus ist es mit der erstellten Methode möglich festzustellen, ob der 1O2 direkt vom Arzneistoff gebildet wird oder erst von einem seiner Photoprodukte. Die Bil-dung von Superoxidanionen wurde mit Hilfe von NBT ebenfalls online nachgewiesen. Damit ist man in der Lage ein photosensibilisierendes Potential eines Arzneistoffes über eine Typ-II- Reaktion nach Foote vorhersagen zu können. Um ein photosensibilisierendes Potential eines Arzneistoffes über eine Typ-I-Reaktion vorhersagen zu können, wurde eine ESR-Methode entwickelt, indem der Arzneistoff in-situ bestrahlt und simultan ein Spektrum aufge-nommen wurde. Anhand der untersuchten Arzneistoffe konnte gezeigt werden, dass es mög-lich ist eine Radikalbildung verursacht durch Licht zu detektieren und über die Zeit zu verfol-gen. Damit können Aussagen über die Reaktivität und Lebensdauer der gebildeten Radikale getroffen werden. Außerdem ist man in der Lage zu detektieren, an welchem Atom sich das Radikal gebildet hat. Folglich ist es möglich zu unterscheiden, ob ein Arzneistoff über eine Typ-I- oder Typ-II-Reaktion phototoxisch wirkt oder sogar über beide Reaktionswege. Ergänzend zu diesen Ergebnissen wurde das Verhalten der bestrahlten Arzneistoffe gegenüber Biomolekülen untersucht, als Modellmolekül wurde Calcitonin verwendet. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Arzneistoffe die auch über eine ausgeprägte ROS-Bildung verfügen, einen starken Abbau von Calcitonin verursachen. Festzustellen war auch, dass nicht alle bekannten Photosensitizer, wie unter anderem Doxycyclin, einen Abbau von Calcitonin verursachen. Durch das Kombinieren des Photoreaktors mit einem LC- ESI-TOF-System war es möglich entstandene Photoprodukte nachzuweisen und teilweise in der Literatur beschriebene Photo-produkte zuzuordnen. Ausgehend von diesen Ergebnissen verspricht eine Weiterentwicklung der Methode hingehend zum Einsatz eines MS-MS Detektors viel Potential, da damit sowohl die Nachweisgrenzen herabgesetzt werden würden, als es auch möglich ist die neugebildeten Photoprodukte zu identifizieren und so Photoreaktionswege für verschiedene Substanzen zu erstellen. Zusammenfassend kann man sagen, dass im Vordergrund der entwickelten Methode ein Screening auf photoxisches oder photoallergenes Potential von Arzneistoffen oder anderen Substanzen steht. Durch die Nutzung dieser Screening-Methode ist es möglich bereits bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe ein phototoxisches oder photoallergenes Potential vorherzu-sagen und darüber hinaus auch über deren photochemischen Wirkungsmechanismus Aussagen zu tätigen.The aim of this work to evaluate the photochemical behavior of drugs and their associated photosensitizing potential by instrumental methods was successfully achieved. In this investigation, an HPLC method was developed, which makes it possible to determinate reactive oxygen species generated from photoirradiated drugs. This was achieved by using various surrogate parameters to detect and create kinetics for the reactive oxygen species. The formation of singlet oxygen under the influence of light was studied with the help of FFA and RNO to various drugs. In the process ketoprofen, furosemide and doxycycline showed the strongest 1O2 formation. Furthermore, it is possible to determine with this method whether the 1O2 is formed directly by the drug or by one of its photoproducts. The formation of superoxide was detected using NBT. The described method allows predicting the photosensitive/phototoxic potential of a drug through a type II reaction. In order to predict the photosensitizing potential of a drug through a type I reaction an electron paramagnetic resonance method was developed. In the developed method, the drug was irradiated during simultaneous spectrum recordings. The result of the drug investigations showed, that it is possible to detect light-induced free radical formation over the time, thus, giving insights into the reactivity and durability of the radicals formed. Moreover, it is possible to determine the position at which the free radical is formed. Accord-ingly, it is possible to distinguish whether a drug reacts phototoxic via a type I or type II reac- tion. In addition to these results, the behavior of irritated drugs in presence of biomolecules has been studied. Calcitonin has been used as a model molecule. It was found that especially the drugs which also showed a pronounced formation of reactive oxygen species, lead to a degra-dation of calcitonin. Not all tested photosensitizers, such as doxycycline, showed a degrada-tion of calcitonin. By combining the photoreactor with an LC-ESI-TOF system, resulting photoproducts were determined. These photoproducts could partially be assigned to the photodegradation products described in the literature. The results promise a further development of the method using an MS-MS detector to have a lot of potential, since both, the detection limit is reduced, and it is also possible to identify the newly formed photoproducts. Therefore, it should be possible to create photo-reaction pathways. The main purpose of the developed method is the screening of the photosensitive and photo-toxic potential of drugs and other substances. Through the use of this screening method, it will be possible to predict the phototoxic or photoallergic potential of pharmaceutical substances in early stage of development. Furthermore, statements about the photochemical mechanism of the drug can be made