Regulation and significance of cardiac bradykinin receptors under pathophysiological conditions

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Material Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Literatur AnhangKinine sind Peptidmediatoren mit vielfältigen physiologischen und pathologischen Funktionen im kardiovaskulären System (Tschöpe et al., 2002). Sie üben ihre Effekte über die selektive Stimulierung der G-Protein gekoppelten Bradykinin-Rezeptoren (BKR), B1 (B1R) und B2 (B2R), aus. Unter basalen Bedingungen vermittelt der konstitutiv exprimierte B2R die meisten der bekannten Kinin-bedingten Effekte. Die B1R-vermittelten Effekte sind im Wesentlichen unbekannt und Studien über kardioprotektive Effekte sind widersprüchlich (Marceau et al., 1998). Einige Studien deuten auf sowohl kurzfristige als auch langfristige kardioprotektive Effekte der Kinine (Tschöpe et al., 1997c, 2000). Die Regulation der BKR-Subtypen ist im Wesentlichen unbekannt. Da die BKR-Expression kann durch Zytokine und oxidativen Stress hochreguliert werden kann (Phagoo et al., 1999; Sabourin et al., 2002), könnten sie auch mit anderen Peptidsysteme, wie dem Renin- Angiotensin-System (RAS), verbunden sein (Dekan et al., 1997; Marin-Castano et al., 2002; Tschöpe et al., 2002). In dieser Arbeit wurde die BKR-Gene auf alternative Transkripte und weitere Promotoren untersucht. Ebenso wurde die kardiale BKR-Regulation in verschiedenen Herzinsuffizienz-Modellen geprüft, die durch eine aktivierte Zytokinkaskade und ein hochreguliertes RAS charakterisiert sind. So wurde der Einfluss von ischämischem Stress nach Induktion eines Myokardinfarktes (MI), Stoffwechselstress nach Induktion von Diabetes mellitus (DM) und mechanischem Stress nach LVH auf die kardialen BKR- mRNA- und Proteinspiegel bestimmt. Weiterhin wurde der Einfluss von metabolischem Stress bei Tieren mit aktiviertem Kallikrein-Kinin-System (KKS) untersucht. Zusätzlich wurde die Rolle der BKR auf die AT1R- und AT2R- Blockade-vermittelten Effekte mit Hilfe pharmakologischer Interventionen und transgenen Tieren untersucht. Die IL1ß-mRNA-Spiegel unter pathophysiologischen Bedingungen wurden verfolgt, sowie der Einfluss des Interleukin-Converting- Enzym-Inhibitors (ICEI) auf die kardiale BKR-mRNA-Expression. Weiterhin die BKR-mRNA-Spiegel wurden bei B1R- und B2R- knockout -Mäusen verfolgt. Im Herzen wurden jeweils zwei verschiedene BKR-mRNA-Transkripte identifiziert, die vermutlich durch alternatives Spleißen entstehen. Beide BKR wurden unter physiolo-gischen Bedingungen in vielen Geweben detektiert, wobei der B1R nur schwer mit sehr sensitiven Methoden nachgewiesen werden kann. Sechs Wochen nach Induktion der LVH war der Herzindex (HI) erhöht, während die linksventrikuläre Funktion (LVP, dP/dtmax, dP/dtmin) nicht schlechter war, bis auf eine erwartete Zunahme des LVEDP. Die scheinoperierten Tiere exprimierten nur schwach B1R-mRNA und die kardiale Überlastung führte zur Zunahme der B1R- und B2R-mRNA-Expression. Die STZ-behandelten Wildtyp- und TGR(hKLK1)-Ratten entwickelten eine schwerwie-gende Hyperglykämie. Dies beeinträchtigte sowohl beim Wildtyp als auch bei den transgenen Tieren LVP, dP/dtmax und dP/dtmin und erhöhte den HI. Wie erwartet exprimierten die TGR(hKLK1)-Tieren humanes KLK- mRNA. Die B1R-, B2R- und IL1ß-mRNA-Expression im linken (LV) und rechten Ventrikel (RV) war im Vergleich zu normo-glykämischen Wildtyp und TGR(hKLK1)-Ratten gesteigert. Die Tiere mit chronisch aktiviertem KKS zeigten im LV und RV höhere B1R- und B2R-mRNA-Spiegel als Wildtyptiere. Die IL1ß-mRNA- Spiegel unterschieden sich nicht. Die Behandlung der diabetischen TGR(hKLK1) mit Icatibant führte zur weiteren Zunahme des HI und zur Reduktion der transgen-verbundenen Verbesserung der LV Funktion. Die B2R- und IL1ß-mRNA- Expression im LV und RV wurde durch Behandlung mit Icatibant reduziert. 6 Stunden und 6 Tage nach Induktion des MI war der HI erhöht und die LV Funktion schlechter. 6 Stunden nach MI war die B1R-mRNA Expression unterhalb des Detektions-levels und die B2R- und IL1ß-mRNA Expression erhöht. 6 Tage nach MI wurden erhöhte B1R- und B2R-mRNA und Proteinspiegel, wie auch IL1ß-mRNA- Spiegel nachgewiesen. Auch 3 Wochen nach MI war die LV Funktion schlechter. Bei infarzierten Ratten wurden im LV und RV erhöhte B1R-, B2R-mRNA- und Protein-expression, ebenso IL1ß-mRNA-Expression detektiert. Der infarzierte Bereich des LV zeigte höhere B1R-, B2R-mRNA und Proteinlevel, ebenso IL1ß- und Kollagen I-mRNA-Spiegel, wie der nicht-infarzierte. Quinapril- und Irbesartan- behandelte Ratten zeigten sechs Tage und drei Wochen nach MI eine verbesserte LV Funktion und einen reduzierten HI. Die Quinapril-behandelte Ratten wiesen eine höhere B1R- und B2R-mRNA-Expression nach MI (6 Tage und 3 Wochen) im Vergleich zu den Vehikel-behandelten Ratten auf. Die AT1R-Blockade führte an beiden Zeitpunkten zur weiteren Zunahme von B1R-mRNA und Protein. Die IL1ß- mRNA-Expression wurde nicht durch die Quinaprilbehandlung verändert, jedoch durch Irbesartan erhöht. Die Expression der Kollagen I-mRNA war im nicht- infarzierten Bereich des LV durch Quinapril und Irbesartan unbeeinflusst, aber im infarzierten Bereich durch Irbesartan reduziert. Um festzustellen, ob eine AT1R-Überstimulierung zu Veränderungen führt, wurden Ratten, die den AT1R, angetrieben mit dem MHC (myosin heavy chain) Promotor, überexprimieren analysiert. Da dieses Promotorkonstrukt bei Tieren, die älter als drei Monate sind, inaktiv ist (Hoffman et al., 2001), wurde der MI bei sechs Wochen alten AT1R-transgen und Kontrollratten induziert. Jedoch führte die AT1R-Über- expression zu beiden Zeitpunkten weder zur Beeinträchtigung der LV Funktion noch des HI. Scheinoperierte Tiere, die den AT1R überexprimieren zeigten gleiche Konzentrationen der B1R-mRNA, aber nach Induktion des MI eine signifikante Runterregulation dieser. Während sich die Gesamt-AT1R-mRNA bei den scheinoperierten TGR-MHCAT1 und Kontrollratten nicht unterschied, waren die Spiegel nach MI im Vergleich zu altersangepassten Wildtypenratten erhöht. Die AT2R-Blockade führte an beiden Zeitpunkten zur Verbesserung von HI und LV Funktion im Vergleich zu den Vehikel-behandelten Ratten. Die B2R-mRNA- Expression wurde durch die PD123319-Behandlung gesteigert. Bei der Herzinsuffizienz haben die beiden BKR eine wichtige Bedeutung und werden unter diesen Bedingungen hochreguliert. Die Mechanismen der B1R-Regulation werden durch den AT1R beeinflusst und der B1R trägt zu den kardioprotektiven Effekten der AT1R-Blockade bei. Auch die IL1ß-Hochregulation ist ein wichtiger Mechanismus zur Hochregulation des B1R, bei der auch andere Zytokine beteiligt sein könnten. Das kardiale Remodeling wird durch Kinine über den B2R beeinflusst und so auch die Kollagensynthese. Auch hierbei spielt die Interaktion mit IL1ß und anderen Zytokinen eine wichtige Rolle. Die Hochregulation beider BKR-Typen während des kardialen Remodelings, herbeigeführt durch LVH-induziertem Stress, durch Hyperglykämie-induziertem oxidativen Stress, wie auch nach Ischämie-induziertem Stress deutet auf eine größere Rolle der Kinine bei den komplexen Prozessen der kardialen Gewebeheilung und Reparatur.Kinins are peptide mediators of a diverse range of physiological and pathological functions of the cardiovascular system (Tschöpe et al., 2002). They exert their biological effects by the selective stimulation of two distinct G-protein coupled receptors termed bradykinin (BK) B1-receptor (B1R) and B2-receptor (B2R). Under basal conditions the constitutive expressed B2R mediate most of the effects usually attributed to kinins. The effects mediated by the B1R are largely unknown, and the results of studies concerning their cardioprotective effects are inconsistent (Marceau et al., 1998). Several works suggests that kinins have both short-term and long-term cardioprotective effects (Tschöpe et al., 1997c, 2000). However, the regulation of the BK receptor (BKR) subtypes involved is largely unknown. Since mRNA expression of both BKR can be up-regulated by cytokines and oxidative stress (Phagoo et al., 1999; Sabourin et al., 2002), it may also dependent on the status of other peptide systems like the renin-angiotensin system (RAS) (Dean et al., 1997; Marin-Castano et al., 2002; Tschöpe et al., 2002). In the present study has proofed the BKR genes for alternate transcripts and further promoters. Also this concept was verified by investigating cardiac BKR regulation in different rat models with cardiac failure, known also to be characterized by an activated cytokine cascade and up-regulated RAS. Thus, the influence of ischemic stress after the induction of myocardial infarction (MI), metabolic stress after induction of diabetes mellitus (DM) and of mechanic stress after pressure-overload induced LVH on cardiac BKR mRNA and protein levels have been determined. More over the influence of metabolic stress after induction of DM in animals with an activated kallikrein kinin system (KKS) was observed. In addition the role of the BKR on the AT1R and AT2R blockade-dependent effects was investigated using pharmacological interventions and transgenic animals. The IL1ß-mRNA levels under pathophysiological conditions and the influence of interleukin converting enzyme inhibitor (ICEI) on the cardiac BKR mRNA levels were followed. Moreover the BKR mRNA levels in B1R- and B2R-deficient mice were studied. For each gene were identified two different BK mRNA transcripts witch formed by alternate splicing. Both BKR subtypes could be detected in different tissues, whereas the B1R could be hard detected only with very sensitive methods. Six weeks after induction of LVH the heart weight-to-body weight ratio (HI) was increased, whereas left ventricular function (LVP, dP/dtmax, dP/dtmin) was not exacerbated. Only an expected increase in LVEDP was found. In sham-operated animals, B1R mRNA was only weakly expressed. Thus, the cardiac overload led to an increase of B1R mRNA. The STZ-induced diabetic and TGR(hKLK1) rats developed severe hyperglycemia. Thereby, LVP, dP/dtmax and dP/dtmin were impaired and HI was increased. As anticipated the human hKLK mRNA was expressed in TGR(hKLK1). The B1R, B2R and IL1ß mRNA expression in the left (LV) and right ventricle (RV) was increased compared to normoglycemic rats in both, wildtyp and TGR(hKLK1) rats respectively. The animals with chronically activated tissue KKS system revealed higher B1R and B2R mRNA level than wildtyp animals in LV and RV. The IL1ß mRNA level did not differ. Treatment of diabetic TGR(hKLK1) with icatibant led to a further increase of the heart weight-to-body weight ratio and, except for LVP, to an attenuation of the transgene-related improvement of the diastolic dysfunction. The B2R and IL1ß mRNA expression level in LV and RV were reduced by the treatment of Icatibant. Six hours and six days after induction of MI the HI was increased and the LV function was aggravated. Six hours after MI the B1R mRNA expression was below the detection level. The B2R and IL1ß mRNA expression were increased. Six days after MI B1R and B2R mRNA and protein level are increased, as well as the IL1ß mRNA level. Three weeks after the induction of MI the LV function is reduced and dP/dtmin was increased as compared to controls. In infarcted rats in LV and RV, B1R and B2R mRNA and protein expression were increased compared to sham-operated rats, also the IL1ß mRNA expression. The infarcted area of the LV showed a higher B1R and B2R mRNA as well as Protein level than the non-infarcted area, more over the IL1ß and collagen I mRNA level. Quinapril and Irbesartan-treated rats showed an improved LV function and reduced HI compared to vehicle-treated rats six days and three weeks after induction of MI. Quinapril-treated SD-rats turned out higher B1R and B2R mRNA expression after induction of MI (6d and 3w) compared to vehicle-treated rats. AT1R blockade led to a further increase of B1R mRNA and protein at both time points. The IL1ß mRNA expression was not altered by the quinapril-treatment, but was increased by irbesartan. The collagen I mRNA in the non infracted area of LV was not affected by both, Quinapril and Irbesartan respectively, but in the infarcted area the mRNA level was reduced by irbesartan. To investigate whether an AT1R over-stimulation would lead to changes, rats over-expressing AT1R driven by an MHC (myosin heavy chain) promoter were analyzed. Since this promoter construct is inactive in animals older than three months (Hoffman et al., 2001), MI was induced in AT1R-transgenic and control rats aged six weeks. However, AT1R over-expression led neither to an impairment of the LV function nor to changes HI at both time points. Sham-operated animals over-expressing AT1R had equal concentrations of B1R mRNA compared to their controls, but a significant down-regulation of B1R mRNA after induction of MI. Whereas total AT1R mRNA did not differ between sham-operated TGR-MHCAT1 and control rats, levels were significantly increased compared to age-matched wild type rats after induction of MI. The AT2R blockade led to an improvement of the HI and LV function compared to vehicle-treated rats at both time points. The B2R mRNA expression was increased by the PD123319-treatment. The both BKR subtypes have an important role in cardiac failure and were up regulated under these conditions. The mechanisms of the B1R regulation are influenced by the AT1R and the B1R contributes to the cardio-beneficial effects of the AT1R blockade. Also IL1ß upregulation is an important mechanism for the upregulation of the B1R, where also additional cytokines can be involved. The cardiac remodeling is influenced by kinins over the B2R and thus also the collagen synthesis. As well here the interaction with IL1ß and additional cytokines plays an important role. Up-regulation of both BKR types during the development of cardiac remodeling induced by pressure-overload induced stress, by hyperglycemia-induced oxidative stress as well as after ischemia-induced stress indicates a major role of kinins in the complex processes of cardiac tissue injury and repair