Comparison of cutaneous expression of esterases in reconstructed human skin reconstructed epidermis and human skin ex vivo

Die Haut ist eine wichtige Körpergrenzfläche, die mit Kosmetika, Arzneimittel und oft mit Chemikalien in Berührung kommt. Für die Abschätzung von Gefahren für Mensch und Umwelt durch neu entwickelte (Neustoffe) sowie bereits etablierte Stoffe (Altstoffe) erlangt auch die metabolische Kompetenz von Humanhaut in Hinblick auf Toxifizierung oder Detoxifizierung Bedeutung. Im Rahmen der REACh-Gesetzgebung sind für Sicherheitstestungen Tierversuche – sofern möglich - durch geeignete in vitro Testsysteme zu ersetzen. Unter den Metabolisierungsenzymen haben Esterasen einen hohen Stellenwert. Dermale Esterasen sind unter anderem an der Aktivierung von Esterprodrugs, wie z.B. Prednicarbat, das zur topischen Therapie von entzündlichen Hauterkrankungen eingesetzt wird, beteiligt. Lipophile Arzneistoffe, wie Ester, können die lipophile Barriere des Stratum corneum überwinden. In der Epidermis werden die Esterschutzgruppen von den aktiven Esterasen abgespalten und - bei Prodrugs - der Wirkstoff freigegeben. Mit der in der vorliegenden Arbeit entwickelten halbautomatischen Fluoresceindiacetat (FDA)-Methode wird die Änderung der Fluoreszenzintensität bei enzymatischer Umsetzung von nicht-fluoreszierendem FDA zu fluoreszierendem Fluorescein innerhalb von 10 Minuten zur Quantifizierung der Esteraseaktivität genutzt. Diese Methode zur Bestimmung der Esteraseaktivitäten in Zellkulturen sowie Geweben kann ohne einen hohen apparativen Aufwand durchgeführt werden und stellt eine einfache, schnelle und preiswerte Alternative zur HPLC-Analytik dar. Diese Methode ermöglichte erstmals den Vergleich der Esteraseaktivitäten (vmax) rekonstruierter Humanhäute (RHS) bzw. Epidermis (RHE) mit frischer Humanhaut. Zusammen mit den weiterführenden Untersuchungen zur Inhibition der Enzyme und der quantitativen PCR-Analytik, konnte ein Teil der verantwortlichen Esterasen (CES1/2 + PON2/3) für die Biotransformation von FDA in der Haut identifiziert werden. Die RHS Phenion FT zeigte dabei die höchste Esteraseaktivität, die mit einer erhöhten CES2-Genexpression in der Epidermis korrelierte. Die Studie hat weiterhin ergeben, dass die RHE EpiDerm bezogen auf die FDA-Biotransformation eine ähnliche metabolische Kompetenz aufweist wie die Humanhaut, weshalb dieses Konstrukt als geeignet für Ester-Biotransformationsuntersuchungen erscheint. Dies steht jedoch im Widerspruch zu den Resultaten der Korrelation, die einen Unterschied zwischen Konstrukten und Humanhaut identifiziert. Das in der Humanhaut nachgewiesene Expressionsmuster der CYP-Enzyme und der Aldo- Ketoreduktase Familie 1 stimmt hingegen mehr mit dem der rekonstruierten Humanhäute (RHS) überein. Die stetig steigende Bedeutung von alternativen in vitro Testmethoden aufgrund gesetzlicher Regelungen wird weitere vergleichende Untersuchungen anderer Enzymstysteme der Haut auf Aktivitäts- und Genexpressionsebene erfordern. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse werden weiterhin dazu führen, dass Versuche an Tieren und/oder Humanhaut reduziert bzw. ersetzt werden können.The skin is an important interface of organisms, which comes into contact with cosmetics, drugs and often chemicals. Due to the REACh legislation, the assessment of risks for humans and the environment because of the production and consumption of newly developed and already established substances is of crucial interest. Therefore, the metabolic capacity associated with toxifying or de-toxifying processes of substances in human skin and skin equivalent, respectively, is focused on. Among the metabolizing enzymes, esterases are found omnipresent not only in human tissues. They play a very important role in biotransformation processes. Dermal esterases are responsible for the activation of ester prodrugs, as Prednicabate, which is used for topical treatment of inflammatory skin diseases with glucocorticoids of medium strength. Drugs with lipophilic structure elements like an ester are able to overcome lipophilic barriers without loss of efficacy. Afterwards, esterases cleave the ester-protecting group of the prodrug and the active agent is released. The developed semi-automatic fluorescein diacetate method (FDA- method) to quantify esterase activity is based on the change of fluorescence intensity by enzymatic hydrolysis of non-fluorescent fluorescein diacetate (FDA) to fluorescent fluorescein within 10 minutes. This FDA-method is a simple, fast and inexpensive alternative to HPLC analysis. For the first time esterase activity (vmax) has been comparatively analysed in reconstructed tissues and human skin. Together with the results of enzyme inhibition and gene expression by real time PCR, CES1/2 and PON2/3 are identified as parts of enzymes which are responsible for FDA biotransformation. The RHS Phenion FT shows highest activity levels, which correlate with its high CES2 gene expression. Furthermore, the study shows that esterase activity of RHE EpiDerm is comparable to that of human skin, thus it seems to be suitable for investigations into ester biotransformation. However, this conflicts with the results of the correlation analyses, which indicate differences between constructs and human skin. In contrast, the gene expression pattern of CYP- enzymes and aldo-ketoreductase family 1 in human skin agrees more with RHS. The continuously rising importance of in vitro alternative methods due to the valid legislation will need more comparable analyses of other enzymes of the skin with regard to activity and gene expression. Those results will lead to further reduction or replacement of animal test or test with human skin