Heterologous expression of a functional domain of the nicotinic acetylcholine receptor

0 Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Synaptische Signaltransduktion 1.2 Struktur des nikotinischen Acetylcholinrezeptors 1.3 Bisher bekannte Teilstrukturen von anderen Ionenkanälen 1.4 Aufgabenstellung: Untersuchung der Struktur einer Proteindomäne 2 Ergebnisse 2.1 Nachweis der erfolgreichen Expression der intrazellulären Domäne 2.2 Expression in Insektenzellen 2.3 Expression in Escherichia coli 2.4 Expression in zellfreien Systemen 3 Diskussion der Ergebnisse 3.1 Expression in Sf9-Insektenzellen 3.2 Expression in E. coli 3.3 In vitro-Expression 3.4 Ausblick 4 Zusammenfassung 5 Summary 6 Material und Methoden 6.1 Methoden zur Proteinbestimmung 6.2 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 6.3 Western Blot 6.4 Molekularbiologische Methoden 6.5 Proteinexpression in E. coli 6.6 Zellkultur von Sf9-Insektenzellen 6.7 Indirekte Immunfluoreszenz von transfizierten Zellen 6.8 Membranpräparation aus transfizierten Zellen 6.9 Reinigung von exprimierten Proteinen 6.10 In vitro-Expression 6.11 Massenspektrometrische Analyse von Peptiden 6.12 Peptidsequenzierung nach Edman 6.13 Materialien 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Vektorkarten und verwendete Sequenzen 8.2 MALDI-Komplettspektrum 8.3 MALDI-PSD-Spektrum 8.4 Abkürzungen und Einheiten 8.5 Eigene Veröffentlichungen 8.6 Lebenslauf 8.7 DanksagungUm die Funktion von ligandengesteuerten Ionenkanälen besser verstehen zu können, muss ihre Struktur in einer Auflösung im Bereich von wenigen Å bekannt sein. Da es sich bei diesen Rezeptoren um sehr komplexe Membranproteine handelt, war eine Kristallisation und anschließende Röntgenstrukturanalyse bisher nicht möglich. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein anderer Ansatz verfolgt, die Struktur des nikotinischen Acetylcholinrezeptors weiter aufzuklären. Die intrazellulären Domänen der alpha-, beta-, gamma- und delta- Untereinheiten des Rezeptors aus Torpedo californica und des alpha7-Rezeptors aus Ratte sollten in verschiedenen Systemen exprimiert werden, um die Struktur dieser Domänen untersuchen zu können. Eine Untersuchung der intrazellulären Domänen ist für die Neurochemie unter anderem deshalb von Bedeutung, weil ihre Beteiligung an der intrazellulären Signalweitergabe wahrscheinlich ist. Bisher gibt es über alle Bereiche des Acetylcholinrezeptors Daten oder zumindest Modelle zu ihrer Struktur, es ist aber noch nichts über die intrazellulären Schleifen bekannt. Diese Schleifen besitzen bei einigen Untereinheiten Phosphorylierungsstellen, und durch Mutationsexperimente wurde ihre Wichtigkeit für das Clustering des Acetylcholinrezeptors an der postsynaptischen Membran gezeigt. Als eukaryontisches Expressionssystem wurde die Sf9-Insektenzellkultur verwendet. Einerseits über das Baculovirus-System, andererseits über direkte Transfektion wurden verschiedene DNA-Konstrukte in die Zellen gebracht. Die Baculovirus-Expression war für die Herstellung der gesuchten Proteine nicht geeignet, weil die Insektenzellen zu schnell starben, um ausreichende Mengen zu exprimieren. Außerdem sind die Prozeduren zur Herstellung der Baculoviren zu zeitaufwendig, um eine größere Zahl von DNA- Konstrukten für die Optimierung der Proteinexpression zu testen. Eine stabil transfizierte Zelllinie, die die intrazelluläre Schleife der delta- Untereinheit exprimiert, wurde etabliert. Mit diesen Zellen wurde eine Reinigungsprozedur für das exprimierte Protein ausgearbeitet. Diese Methode kann weiter optimiert werden, um ausreichende Mengen des gesuchten Proteins zu erhalten. Desweiteren wurden mehrere DNA-Konstrukte für verschiedene Fusionsproteine im prokaryontischen Expressionssystem E. coli versucht zu exprimieren. Von den intrazellulären Schleifen der delta- und der alpha7-Untereinheit wurden trunkierte Versionen in unterschiedliche Vektoren eingebracht. Für einige der Konstrukte konnte eine gute Expression erreicht werden, allerdings ließ sich das Protein meist nicht ohne Verwendung von hohen Konzentrationen an Detergenz aufreinigen. Das GST-Fusionsprotein der alpha7-Schleife konnte schließlich aus Bakterien mit einer Konzentration von 30 µg/ml isoliert werden. Als weitere Methode wurde die zellfreie Expression mit zwei In vitro-Systemen der Firmen Roche und RiNA getestet. Es wurden mehrere Expressionsversuche mit verschiedenen intrazellulären Schleifen durchgeführt. In einem Ansatz konnte erfolgreich die intrazelluläre delta- Schleife in kleiner Menge exprimiert und durch Ni2+-Affinitätschromatographie angereichert werden. Die Ausführungen zeigen, dass die Expression in zellfreien Systemen insbesondere von problematischen Proteinen für weitere Untersuchungen parallel zu anderen Expressions-Methoden in Betracht zu ziehen ist. Um für Strukturuntersuchungen ausreichende Proteinmengen der intrazellulären Domänen des nAChR zu erhalten, sind die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Methoden entsprechend weiter zu optimieren.For understanding the function of ligand-gated ion channels at a molecular level, the structure of such channels at a few Å-resolution has to be known. Since these receptors are complex membrane proteins, crystallization and follow-up x-ray structure analysis of these channels was not possible up to now. Therefore, a different approach to further clarify the structure of the nicotinic acetylcholine receptor is presented in this thesis. To examine the structure of these domains, it was intended to express some of the receptor's intracellular domains in different cellular systems. Due to their likely participation in intracellular signal processing, studying these intracellular domains is of great value for neurochemical studies. For the rest of the receptor molecule, data and modellings of the structure are published but nothing is known about the intracellular loops. The loops contain for example phosphorylation sites in certain subunits, which are important for clustering of acetylcholine receptors at postsynaptic membranes, as mutation experiments had shown. Sf9-insect cells were used as eukaryotic expression system. Different DNA constructs were introduced into cells by baculovirus systems as well as by transfection with lipid reagents. The baculovirus expression however did not prove to be suitable for expressing the desired proteins. After infection the insect cells died before the expression of sufficient amounts of protein could be observed. In addition, the viral procedure is far too time consuming to test a large number of DNA constructs for optimizing the protein expression. Finally, a stable Sf9 cell line was established that expresses the intracellular loop of the delta-subunit. By using these cells, a procedure to purify the expressed delta-loop was developed. This procedure may be used to optimize the expression in order to obtain protein amounts sufficient for structural studies. In E. coli, the expression of the intracellular loop in a prokaryotic context was tested for several DNA constructs encoding fusion proteins with soluble proteins like GST. Truncated versions of the intracellular loops of the delta- and the alpha7-subunits were in-troduced in different vectors. For some constructs a satisfying expression was achieved. However, the proteins could be purified only in small amounts applying high detergent concentrations, and with unpredictable yields. The GST-fusion protein of the alpha7-subunit was isolated from bacteria at a concentration of 30 µg/ml and a total yield of 45 µg. As a third method, cell- free expression was tested using two in vitro-systems from the companies Roche and RiNA for the different intracellular loops. Only the intracellular delta- loop was once successfully expressed in a small amount and enriched by Ni2+-affinity chromatography. The expression in cell-free systems, in particular regarding unusual proteins, can therefore be considered to complement other expression methods. To obtain amounts of the nAChR intracellular loop, sufficient for solving its structure, the procedures here will have to be developed further