Effect of antimicrobial peptides (AMP) in boar sperm preservation

Antibiotika sind für die Flüssigkonservierung von Sperma von herausragender Bedeutung. Aufgrund der rasanten und weltweiten Entwicklung von Antibiotikaresistenzen im verdünnten Sperma besteht die Notwendigkeit, Alternativen zu konventionellen Wirkstoffen zu entwickeln. Die Anwendung antimikrobieller, synthetischer Peptide als Verdünnerzusatz stellt ein Novum für die Reproduktionsbiologie dar. Die Arbeit dokumentiert Versuche, in denen zyklische Hexapeptide, helikale Magainin-Derivate und Kombinationen aus Gentamicin und Peptiden in einem "split-sample"-Verfahren zur Flüssigkonservierung von Eberspermien bei 16 °C aufbereitet und mit dem Kontrollverdünner Beltswille Thawing Solution + 544 µM Gentamicin verglichen wurden. Die spermatologische Untersuchung ergab, dass die getesteten Peptide mit der eukaryotischen Spermienmembran interagierten. Es kam peptid- und konzentrationsabhängig zu einer Schädigung der Zellen. Der Vitalitätsverlust gegenüber dem Standardverfahren hielt sich bei niedrigen Konzentrationen der Hexapeptide WFW (4 µM) und WWW (2 µM) und im kombinierten Einsatz mit Gentamicin (34 µM) in für die Praxis vertretbaren Grenzen. Durch Verwendung der Elektronenspinresonanzspektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Peptide vornehmlich mit Lipiden auf der exoplasmatischen Membranhälfte in Wechselwirkung treten. Die Hexapeptidzusätze bewirkten eine reversible Immobilisierung des spinmarkierten Fettsäurelipids Phoshatidylcholin in der Spermienzellmembran. Der Zusatz des Magainins MK5E führte zu einer irreversiblen Membranfluidisierung. Bindungsstudien fluoreszenzmarkierter Peptide an Eberspermien mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zeigten, dass beide Peptidgruppen unterschiedliche, aber typische Lokalisationsmuster aufwiesen. Unabhängig vom mikrobiologischen Untersuchungsmedium war die für alle vier Peptide an den bakteriellen Referenz- (nach CLSI M31-A2), Labor- und Wildtypstämmen ermittelte minimale inhibitorische Konzentration für die Anwendung im Sperma nicht geeignet, da die spermatologisch akzeptable Konzentration wesentlich niedriger lag. Die kombinierte Anwendung einer reduzierten Gentamicinkonzentration in Verbindung mit den Peptiden WFW oder WWW in der Spermakonservierung reduzierte die mikrobiologische Belastung der Proben auf ein mit dem Kontrollverdünner vergleichbares Niveau. Dagegen führte Gentamicin in geringer Konzentration (34 µM) ohne Peptidzusatz zu einem deutlichen Anstieg der Keimzahl. Erfolg versprechend erscheint nach den Ergebnissen dieser Arbeit die weiterführende Untersuchung des kombinierten Einsatzes von 4 µM WFW bzw. 2 µM WWW und Gentamicin.Antibiotics are essential components of semen extenders to control bacterial contamination and growth. Galloping worldwide resistance to conventional antibiotics in semen extenders requires the development of alternative solutions to common antibiotics. Therefore, cationic antimicrobial peptides attract central interest as a novel class of antimicrobial additives in boar sperm preservation. The present study investigates the spermatological and microbiological effects of cyclic hexapeptides and helical magainin derivatives on boar sperm conservation during semen storage at 16 °C. Combinations of the standard antibiotic gentamicin with single peptides were also tested and compared to the control extender beltswille thawing solution + 544 µM gentamicin. The ejaculates were prepared in a split-sample process. Spermatological examination revealed interaction of the tested peptides with eukaryotic membranes of sperm cells as well as peptide and concentration- dependent negative effects on spermatozoa. However, in low peptide concentrations of the cyclic hexapeptides WFW (4 µM) or WWW (2 µM), alone or in combination with a reduced gentamicin (34 µM) concentration, the total amount of damaged cells remained in a range comparable to the control extender. Electron spin resonance spectroscopy detected differential interactions of the peptides with different lipids, in particular in the outer leaflet of the sperm membrane. Cyclic hexapeptides reversibly immobilized the spin-labelled phoshatidylcholin. By contrast, magainin MK5E caused irreversible membrane fluidization. Confocal Laser-Scanning-Microscopy with fluorescein-labelled peptides showed staining patterns typical for each group of peptides. Independent of the microbiological culture medium, minimal inhibitory peptide concentrations specified for reference strains (according to CLSI M31-A2), laboratory strains, and wild-type strains of bacteria were not suitable for use in sperm preservation due to lower than acceptable concentration values for spermatology. Combined application of peptides WFW or WWW and reduced gentamicin concentration (34 µM) in BTS produced microbiological results comparable to the control extender. Furthermore, bacterial contamination in low gentamicin-concentrated semen (34 µM), without peptides, were found to be high compared to the control extender. In summary, synergism of 4 µM WFW or 2 µM WWW and gentamicin provide a promising basis for further investigation of peptide antibiotic-based media for boar sperm preservation