The regulation of the transcription factor Carbohydrate Responsive Element Binding Protein (ChREBP) in Hep G2 cells

Einleitung: Eine exzessive Akkumulation von Triacylglycerinen in der Leber kennzeichnet die in industrialisierten Ländern weit verbreitete Nicht- alkoholische Fettleber-Erkrankung (NAFLD) und ist in hohem Maße mit Adipositas, Insulinresistenz und Diabetes mellitus Typ 2 assoziiert. Der Transkriptionsfaktor ChREBP (Carbohydrate responsive element binding protein) spielt eine zentrale Rolle für die Regulation der Lipidsynthese in der Leber, indem er die Transkription einer Reihe von Genen kontrolliert, die für wichtige Enzyme der Glycolyse und Lipogenese codieren, wie zum Beispiel L-PK (Leber-Pyruvatkinase), FAS (Fettsäure-Synthase) und ACC (Acetyl-Coenzym A-Carboxylase). Aufgrund der vermutlich großen pathophysiologischen Bedeutung von ChREBP könnten Pharmaka, die diesen Transkriptionsfaktor beeinflussen, in Zukunft potentiell einen wichtigen Ansatzpunkt in der Therapie von NAFLD und Diabetes mellitus Typ 2 darstellen. Voraussetzung für die Entwicklung derartiger Pharmaka ist die genaue Kenntnis der Regulation von ChREBP. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Faktoren, die an der Regulation von ChREBP in humanen Leberzellen möglicherweise beteiligt sind. Methodik: Alle Experimente wurden mit Zellkulturzellen der Linie Hep G2 durchgeführt. Reaktion und subzelluläre Lokalisation von ChREBP-Protein nach den Stimulationen wurden mittels Western Blots beurteilt, die Reaktion von ChREBP- mRNA mittels qRT-PCR (quantitativer Reverse Transkriptase-Real Time-PCR). Die Zellen wurden mit Glucose, Fructose, Glucagon und Insulin stimuliert. Die Stimulationszeit betrug für die Protein-Analysen zwei sowie 24 Stunden, für die mRNA-Analysen vier sowie 24 Stunden. Als Kontrolle dienten stets die weiterhin mit Glucose 1 g/l kultivierten Zellen. Für die Western Blot-Analysen wurden die Proteine aus den Zellen extrahiert, getrennt nach Cytosol- und Kernfraktion, und mittels SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Gel-Elektrophorese) und Western Blot-Verfahren aufgearbeitet. Nach Zugabe eines Anti-ChREBP- Antikörpers konnte die relative Konzentration der ChREBP-Proteine im Chemolumineszenz-Immunoassay gemessen werden. Als Bezugsproteine dienten Tubulin für die Cytosol- und Lamin für die Kernfraktion. Für die qRT-PCR- Analysen wurde nach den Stimulationen die mRNA von ChREBP in cDNA umgeschrieben; Amplifikation und relative Quantifizierung der cDNA erfolgten mittels Real Time-PCR. Bezugs-mRNA war Actin. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse wurde der Welch-Test (t-Test für zwei unabhängige Stichproben mit ungleicher Varianz) angewandt. Ergebnisse: Die Stimulation mit Glucose 2 g/l führte nach zwei Stunden zu einem signifikanten Abfall des ChREBP-Proteins im Cytosol und einem signifikanten Anstieg im Nucleus, nach 24 Stunden zu einem leichten Anstieg im Cytosol und zu einem geringeren Anstieg im Nucleus als nach zwei Stunden. Die mRNA von ChREBP war nach vier Stunden erhöht und nach 24 Stunden erniedrigt. Fructose 1 g/l führte ebenfalls nach zwei Stunden zu einem signifikanten Abfall von ChREBP-Protein im Cytosol und einem signifikanten Anstieg im Nucleus, nach 24 Stunden zu einem Anstieg von ChREBP in Cytosol und Nucleus. Die mRNA von ChREBP war nach vier Stunden erhöht und nach 24 Stunden verringert. Alle beschriebenen Effekte waren schwächer ausgeprägt als nach Stimulation mit Glucose. Die Stimulation mit 50 nmol/l Glucagon zeigte nach zwei Stunden einen Anstieg von ChREBP-Protein im Nucleus und nahezu keine Änderung im Cytosol, nach 24 Stunden einen leichten, signifikanten Anstieg im Cytosol und einen starken Anstieg im Nucleus. Bei der mRNA waren nach vier Stunden ein signifikanter Anstieg und nach 24 Stunden ein Abfall zu beobachten. Durch Insulin kam es kurzfristig zu einem Anstieg von ChREBP-Protein im Cytosol, einem Abfall im Nucleus und einer Senkung der mRNA, langfristig zu einem starken, signifikanten Abfall der mRNA. Diskussion: Die Ergebnisse sprechen für eine durch Glucose verursachte Translokation von ChREBP in den Nucleus, eine Steigerung der Transkription des ChREBP-Gens und eine Neusynthese des ChREBP-Proteins. Die aktivierenden Effekte von Glucose auf ChREBP schwächen sich einerseits mit steigender Glucosekonzentration ab, andererseits mit der Dauer der Stimulation. Die Abschwächung könnte eine zelluläre Gegenregulation darstellen, die dem Schutz vor Lipotoxizität dient und durch Metabolite der von ChREBP induzierten Stoffwechselwege zustande kommt. ChREBP ist auch in glucosefreiem Medium zum Teil im Nucleus lokalisiert, was auf eine konstitutive Aktivität von ChREBP schließen lässt. Fructose führt ebenfalls zur nucleären Translokation und Transkription von ChREBP, allerdings in schwächerem Ausmaß als Glucose. Eine in der Literatur beschriebene stark lipogene Wirkung von Fructose scheint demnach nicht über diese Prozesse verursacht zu werden, sondern könnte mit dem Metabolismus von Fructose oder der fehlenden Auslösung einer Insulinsekretion durch Fructose zusammenhängen. Fraglich bleibt, ob Fructose das Glucose-sensing module (GSM) von ChREBP beeinflussen und somit dessen DNA-Bindung und Aktivität als Transkriptionsfaktor regulieren kann. Glucagon scheint die nucleäre Translokation von ChREBP sowohl kurz- als auch langfristig zu steigern und kurzfristig auch die Transkription zu erhöhen. Alternativ kommt als Erklärung eine Steigerung der Glucoseproduktion der Zellen durch Glucagon in Betracht, die schließlich zur Stimulation von ChREBP durch die produzierte Glucose führt. Insulin führt scheinbar zur Translokation des ChREBP-Proteins ins Cytosol und zu einer kurz- und langfristigen Hemmung der Transkription des ChREBP-Gens. Hier wäre als alternative Erklärung vorstellbar, dass Insulin zu zunehmendem Glucoseverbrauch führt und der entstehende Glucosemangel eine Hemmung von ChREBP bewirkt. ChREBP wird kurzfristig offenbar vorwiegend über seine subzelluläre Lokalisation mittels Translokation reguliert, langfristig vorwiegend über Genaktivierung und Protein-Synthese.Introduction: An excessive accumulation of triacylglycerol in liver characterizes Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), which is widely spread in industrialized countries and is associated to a great extent with obesity, insulin resistance and diabetes mellitus type 2. The transcription factor ChREBP (Carbohydrate responsive element binding protein) plays a central role in the regulation of hepatic lipogenesis by controlling the transcription of several genes which encode important enzymes involved in glycolysis and lipogenesis, for example L-PK (liver pyruvate kinase), FAS (fatty acid synthase), and ACC (acetyl coenzyme A carboxylase). Because of the presumably great pathophysiological importance of ChREBP, medicaments targeting this transcription factor could potentially contribute significantly to the future therapy of NAFLD and diabetes mellitus type 2. For the development of such medicaments, an exact knowledge of the regulation of ChREBP is required. The aim of this study was the investigation of some factors possibly involved in the regulation of ChREBP in human liver cells. Methods: All experiments were performed with cell culture cells from the Hep G2 cell line. The reaction and subcellular localization of ChREBP protein after different stimulations were evaluated using Western Blot technique, the reaction of ChREBP mRNA using qRT- PCR (quantitative reverse transcription real-time PCR). The cells were stimulated with glucose, fructose, glucagon, and insulin. The stimulation period was two and 24 hours for Western Blots as well as four and 24 hours for qRT-PCR. The cells which were further cultivated with glucose 1 g/l served as a control sample in each experiment. For the Western Blots analyses, the proteins were extracted from the cells and divided in cytosolic and nuclear fraction; then, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) and Western Blots were performed. After adding an anti-ChREBP antibody, the relative concentration of ChREBP proteins could be measured using chemoluminescence immunoassay. As housekeeping proteins, there were used Tubulin for the cytosolic fraction and lamin for the nuclear fraction. For the qRT-PCR analyses, the ChREBP mRNA was transcribed in cDNA after the stimulations. Amplification and relative quantification of the cDNA were performed using real-time PCR. Actin was used as housekeeping mRNA. To determine the statistical significance of the results, the Welch´s t-test (t-test for two unrelated samples with unequal variances) was applied. Results: Stimulation with glucose 2 g/l for two hours led to a significant decrease of cytosolic ChREBP protein and to a significant increase of nuclear ChREBP protein. Stimulation with glucose 2 g/l for 24 hours led to a slight increase of cytosolic ChREBP protein and to an increase of nuclear ChREBP protein which was not as pronounced as after two hours. ChREBP mRNA was increased after four hours and decreased after 24 hours. Fructose 1 g/l also led to a significant decrease of cytosolic ChREBP protein and to a significant increase of nuclear ChREBP protein after two hours as well as to an increase of cytosolic and nuclear ChREBP protein after 24 hours. ChREBP mRNA was increased after four hours and decreased after 24 hours. All these effects were less pronounced than after stimulation with glucose. Stimulation with glucagon 50 nmol/l for two hours showed an increase of nuclear ChREBP protein and virtually no change of cytosolic ChREBP protein; stimulation for 24 hours showed a slight but significant increase of cytosolic ChREBP protein and a distinct increase of nuclear ChREBP protein. ChREBP mRNA was significantly increased after four hours and decreased after 24 hours. Insulin led to an increase of cytosolic ChREBP protein and to a decrease of nuclear ChREBP protein as well as to a decrease of ChREBP mRNA after short-term stimulation. Long-term stimulation showed a pronounced and significant decrease of ChREBP mRNA. Discussion: The results suggest that glucose induces the translocation of ChREBP into the nucleus and enhances the transcription of the ChREBP gene and the synthesis of ChREBP protein. The activating effects of glucose on ChREBP diminish with increasing glucose concentration, on the one hand, as well as with increasing stimulation period, on the other hand. This attenuation could represent a cellular counterregulation which might serve as a protection from lipotoxicity and could be accomplished by metabolites from the metabolic pathways induced by ChREBP. Also in glucose free medium, ChREBP is partially localized in the nucleus; this suggests a constitutive activity of ChREBP. Fructose also leads to nuclear translocation and transcription of ChREBP, but to a lower extent than glucose. Therefore, the strong lipogenic effect of fructose which is described in many studies does not appear to be caused by these processes, but may be due to the metabolism of fructose or to the missing activation of insulin secretion by fructose. It remains questionable if fructose is able to influence the glucose sensing module (GSM) of ChREBP and thus to regulate its DNA binding ability and activity as a transcription factor. Glucagon appears to enhance the nuclear translocation of ChREBP after short-term and long-term stimulation and to increase the transcription after short-term stimulation. As an alternative explanation, glucagon might lead to an increased glucose production by the cells that finally results in a stimulation of ChREBP by the produced glucose. Apparently, insulin leads to a translocation of ChREBP protein into cytosol and to a short-term and long-term inhibition of the transcription of the ChREBP gene. Again as an alternative explanation, insulin may lead to an increased consumption of glucose and the lack of glucose may result in an inhibition of ChREBP. The short-term regulation of ChREBP appears to include mainly cytosolic respectively nuclear translocation, the long-term regulation mainly transcription of the ChREBP gene and protein synthesis