The role of the amino acids L188, Y272, Y277, L278 and Y457 on the phospholipid- and lipopolysaccharidetransfer of the lipopolysaccharide- binding-protein (LBP) through mutagenesis

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Literaturverzeichnis AnhangDas Lipopolysaccharid-Binde-Protein (LBP) ist ein Akute-Phase-Protein, das Endotoxine gramnegativer Bakterien bindet und an Zellen des angeborenen Immunsystems transferiert. Dadurch löst es eine Entzündungsreaktion aus, die im lokalen Rahmen vorteilhaft ist für die Bekämpfung des Krankheitserregers. Bei der systemischen Endotoxinämie kann es aber zu einer unkontrollierten, überschießenden Immunreaktion kommen, die zum schweren Krankheitsbild der Sepsis führen kann. LBP gehört zur Familie der LPS-Bindungs- / Lipid-Transfer- Proteine, einer Gruppe von vier Proteinen, die untereinander große Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz und der Form haben. Bei anderen Vertretern der Gruppe wurden apolare Lipid-Binde-Taschen entdeckt, die funktionell wichtig sind für den Transfer des jeweiligen proteinspezifischen Lipidmoleküls. Daher stellte sich die Frage, ob diese Taschen auch Bedeutung haben für den Transfer von Lipopolysaccharid und Phospholipiden durch LBP. Dazu wurden fünf Mutanten von LBP hergestellt, wobei an jedem Mutanten eine Aminosäure im Bereich der apolaren Taschen ausgetauscht wurde. Mit diesen Mutanten wurden dann funktionelle Tests durchgeführt: Es wurde untersucht, ob die Mutanten genauso gut wie Wildtyp-LBP an drei verschiedene Arten von LPS in Aggregatform binden. Außerdem wurde der Transfer von einzelnen LPS-Monomeren an CD14 durch die LBP- Mutanten betrachtet. Bei allen Untersuchungen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den LBP-Mutanten und dem LBP-Wildtyp. Hieraus läßt sich schließen, daß die apolaren Lipid-Binde-Taschen wahrscheinlich keine Bedeutung besitzen für den Transfer von Lipopolysaccharid durch LBP. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob sich die durchgeführten Mutationen auf die Bindung von LBP an Phospholipide auswirken und auf den Transfer von Lipopolysaccharid an Phospholipidmembranen. Diese Fragen konnten nicht beantwortet werden, da das Zellkulturmedium, in dem die LBP-Mutanten gelöst waren, die Bindung zwischen LBP und Phospholipiden blockierte. Eine Trennung von LBP und Kulturmedium durch Ionen-Austausch-Chromatographie mißlang.Lipopolysaccharid-Binding-Protein (LBP) is an acute-phase-protein which binds endotoxin of gramnegative bacteria and transfers it to cells of the innate immune system. This makes it possible for the host to recognize and fight the invading pathogen. LBP belongs to the family of lipid-binding proteins. In other members of this family there were regions found being important for lipid binding. So the question raised whether lipopolysaccharid binds with its fatty acid rests in similar lipid binding pockets also in LBP. Therefore five mutants of LBP with mutations in the hypothetic lipid binding pockets were produced to prevent binding of LPS to LBP. But the results show no significant difference between the mutated and the not changed LBP. It can be concluded that LPS binds in other areas than in the investigated lipid binding pockets. Additionally the influence of these mutations on the phospholipid transfer of LBP was examined. These tests all failed because of technical problems