Leukämieassoziierte genetische Aberrationen in mesenchymalen Stammzellen von Kindern mit akuter lymphoblastischer Leukämie

CONTENT SUMMARY 6 1 INTRODUCTION 7 1.1 Childhood acute lymphoblastic leukemia 7 1.1.1 Features of the ALL disease 7 1.1.2 Characterization of ALL 7 1.1.2.1 Immunophenotype 7 1.1.2.2 Morphology 9 1.1.2.3 Genetic aberrations 9 1.1.3 Treatment of childhood ALL 13 1.2 Hematopoiesis 18 1.2.1 Stem cells / hematopoietic stem cells 18 1.2.3 MSC as origin of the HSC BM-niche 21 1.2.3.1 Characterization of MSC 21 1.2.3.2 Role of MSC in the physiology of BM-cells 22 1.2.3.3 Interaction of MSC and immune cells 22 1.2.3.4 Clinical applications of MSC 23 1.3 Aberrant hematopoiesis 23 1.3.1 Leukemia stem cells theory 23 1.3.2 Origin of leukemia cells 24 1.3.3 Leukemia cells and MSC interaction 26 1.3.3.1 Tumor and MSC / stroma interaction 26 1.3.3. Leukemia cell niche 26 1.3.3.3 Genetic alterations in tumor-associated stroma cells 28 1.4 Plasticity of stem cells 28 1.5 Aim and outline of the thesis 30 2 MATERIALS AND METHODS 31 2.1 Patients 31 2.2 Isolation and characterization of MSC 31 2.3 CFU-F assays 32 2.4 Differentiation of MSC 32 2.5 Immunostaining 32 2.6 Metaphase analysis 33 2.7 Fluorescence in situ hybridization 33 2.8 Multi- color FICTION 34 2.9 Cell lines 34 2.10 Transduction of MSC with the SV40 Large T-antigen 35 2.11 Immunoglobulin gene rearrangements 35 2.12 Sequencing of the MLL-ENL breakpoint in MSC 36 2.13 Western blot analysis 36 3 RESULTS 37 3.1 Characterization of MSC from childhood ALL patients 37 3.2 Leukemia- associated genetic alterations in MSC 40 3.3 TEL-AML1 fusion gene 41 3.3.1 Frequency of TEL-AML1 fusion gene in MSC of children with ALL 41 3.3.2 Detection of additional aberrations in MSC from patient 5 43 3.3.3 Frequency of leukemia-specific IG gene rearrangements in MSC 45 3.3.4 SV40-Tag MSC from a TEL-AML1+ patient and a healthy donor 48 3.3.4.1 Characterization of SV40-Tag MSC 48 3.3.4.2 Frequency of TEL-AML1 and additional aberrations in SV40-Tag MSC 49 3.4 E2A-PBX1 fusion gene 52 3.4.1 Frequency of E2A-PBX1 fusion gene in MSC of children with ALL 52 3.4.2 Frequency of E2A-PBX1 fusion gene in SV40-Tag MSC 53 3.5 MLL (11q23) rearrangements 57 3.5.1 Frequency of MLL-ENL fusion gene in MSC of children with ALL 57 3.5.2 Disease time course of the male ALL patient 10 with the t(11;21) translocation and analysis of MNC and MSC 59 4 DISCUSSION 63 4.1 Isolation and characterization of MSC 63 4.2 Leukemia-associated genetic aberrations in MSC 63 4.3 Clonal relationship between MSC and leukemia cells 64 4.4 Models explaining the presence of leukemia-associated aberrations in MSC 65 4.5 Cell type specific role of fusion genes 68 4.6 Presence of additional genetic aberrations in MSC 68 4.7 Final remarks 69 5 ZUSAMMENFASSUNG 70 6 REFERENCES 72 7 APPENDIX 88 8 ABBREVIATIONS 90 9 PUBLICATIONS 92 10 ACKNOWLEDGEMENTS 93Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer in childhood. The disease is caused by malignant immature lymphocytes or their progenitors. Therapy for children with initial ALL has proven to be quite successful (85% long-term survival), but the treatment outcome for relapsed ALL remains unsatisfactory (approximately 40% long-term survival). ALL subtypes can be classified according to their immunophenotype, morphology and specific genetic alterations using cytogenetic analysis. These genetic alterations include structural or numerical chromosome changes such as translocations or hyperdiploidy, deletions and amplifications. Analysis of the chromosomal translocations and the resulting fusion genes has improved the understanding of the biology of leukemia cells (LC). However, as previously suggested, the understanding of leukemia pathogenesis also requires an extended knowledge of not only the specific genetic mutations implicated, but also of the cellular framework, in which they arise, develop and are maintained. The bone marrow (BM) microenvironment promotes survival and differentiation of hematopoietic stem cells (HSC) and lymphocytes. The BM contains at least two different types of progenitor cells, HSC and mesenchymal stem cells (MSC). MSC are able to differentiate into multiple mesenchymal lineages, including bone, cartilage, muscle, fat tissue and BM stroma cell. MSC facilitate engraftment of HSC and seem to persist in the BM after chemotherapy. The plasticity of MSC to differentiate into cells of the hematopoietic lineage has been demonstrated in mice. Furthermore, recent studies have demonstrated the reprogramming of B-cells and other somatic cell types like fibroblasts into pluripotent stem cells by ectopic expression of defined transcription factors, indicating the high plasticity of virtually any cell. Therefore, we analyzed MSC from B cell precursor ALL patients for the presence of leukemia-associated chromosomal translocations and immunoglobulin (IG) gene rearrangements. Leukemia-specific IG / T cell receptor (TCR) gene rearrangements and junctional regions are widely used as clonal leukemic markers for the detection of minimal residual disease (MRD). Leukemia cells from 10 of 49 patients showed one of the three translocations namely TEL-AML1, E2A-PBX1 or MLL rearrangement. Leukemia- associated aberrations were detected in MSC of these 10 ALL patients independent of the sampling time points. Leukemia-specific IG gene rearrangements were detected in MSC from 3 of the 8 analyzed patients. These results suggest a clonal relationship between MSC and leukemia cells.Die akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist die häufigste maligne Erkrankung im Kindesalter. Die Erkrankung wird durch entartete unreife Lymphozyten oder ihre Vorläufer verursacht. Die derzeit zur Verfügung stehenden Therapien erreichen bei Kindern mit Ersterkrankung eine Langzeit-Überlebenssrate von 85%, aber die Heilungsaussichten nach einem Rezidiv liegen bei nur etwa 40%. ALL-Subtypen werden anhand ihres Immunphänotyps, ihrer Morphologie und ihrer speziellen genetischen Mutationen klassifiziert. Diese genetischen Aberrationen beinhalten strukturelle oder numerische Veränderungen der Chromosomen, wie Translokationen oder Hyperdiploidie, Deletionen und Amplifikationen. Die Analysen der chromosomalen Translokationen und der daraus resultierenden Fusionsgenen haben zum besseren Verständnis der Biologie von Leukämiezellen beigetragen. Das bessere Verständnis der Pathogenese von Leukämien erfordert nicht nur das erweiterte Wissen über die speziellen Mutationen, die sie beinhalten, sondern auch über das zelluläre Netzwerk, in denen diese Mutationen entstehen und sich entwickeln. Das Mikromilieu des Knochenmarks (KM) fördert Überleben und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) und Lymohozyten. Im KM befinden sich zwei verschiedene Typen von Vorläuferzellen, HSZ und mesenchymale Stammzellen (MSZ). MSZ haben die Fähigkeit zu verschiedenen Zelltypen aus der mesenchymalen Linie zu differenzieren, wie etwa zu knochenbildenden Zellen, Muskel- und Fettzellen sowie KM-Stromazellen. MSZ erleichtern das Anwachsen von transplantierten HSZ und scheinen auch chemoresistent zu sein. In Mäusen wurde die Fähigkeit von MSZ auch zu Zellen der hematopoietischen Linie zu differenzieren demonstriert. Darüber hinaus konnten neuere Studien zeigen, dass reife B-Zellen und andere somatische Zelltypen wie Fibroblasten zu pluripotenten Stammzellen reprogrammiert werden können, indem genau definierte Transkriptionsfaktoren in diesen Zellen exprimiert werden. Folglich zeigen diese Daten, dass fast alle Zellen eine hohe Plastizität besitzen. Aus diesen Gründen untersuchten wir MSZ aus Patienten mit B-Zell-Vorläufer-ALL auf das Vorhandensein von leukämiezellen-assoziierten chromosomalen Aberrationen und Immunglobulin- Genumlagerungen. Die Produkte der TCR/IG-Genumlagerungen stellen leukämieklon- spezifische Marker dar, mit denen minimale Resterkrankung (MRD) während der Behandlung nachgewiesen werden können. Leukämiezellen aus 10 von 49 Patienten zeigten eine von drei Translokationen, entweder TEL-AML1, E2A-PX1, oder MLL- Rearrangement. Leukämie-assoziierte Aberrationen wurden in MSZ aus all diesen 10 ALL-Patienten nachgewiesen, unabhängig vom analysierten Zeitpunkt. Des Weiteren konnten in 3 von 8 Patienten leukämie-assozierte IG-Genumlagerungen detektiert werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine klonale Verwandtschaft zwischen MSZ und Leukämiezellen hin