Treatment of toxoplasmic encephalitis, in-vitro and in-vivo models to study passage of antiparasitic drugs through the blood-brain barrier

Titelblatt, Danksagung und Inhalt 1\. Einleitung 2\. Problemstellung und Zielsetzung der Arbeit 3\. Material und Methoden 4\. Ergebnisse und Diskussion. 4.1. In-vitro-Untersuchungen mit Zellen der BHS 4.2. In-vivo-Untersuchungen im Infektionsmodell der Reaktivierungstoxoplasmose 5\. Zusammenfassung 6\. Summary 7\. Abkürzungsverzeichnis 8\. Literaturverzeichnis 9\. Curriculum vitae 10\. Publikationen und KongressbeiträgeT. gondii verursacht eine in der Regel asymptomatisch verlaufende Infektion, die durch Persistenz des Erregers in Zysten vor allem im zentralen Nervensystem charakterisiert ist. Unter Immunsuppression (z.B. AIDS-Patienten, Transplantierte) kommt es zu einer Reaktivierung der Infektion, die unbehandelt unter dem Bild einer Enzephalitis tödlich verläuft. Die Therapie der Reaktivierungstoxoplasmose, einer der häufigsten zerebralen Infektionen bei Immunsupprimierten, setzt sich aus einer mindestens vierwöchigen Akut- Behandlung, gefolgt von einer lebenslang durchzuführenden Erhaltungstherapie, zusammen. Standardtherapeutika wie Pyrimethamin und Sulfadiazin sind durch hohe Toxizität oder Allergisierung gekennzeichnet; alternative Wirkstoffe werden nur wenig resorbiert und/oder sind wenig gehirngängig. Die Wirkstoffapplikation in Form von oberflächenmodifizierten Nanosuspensionen ermöglicht das gezielte Targeting von Zellen im zentralen Nervensystem. Um die Passage von Wirkstoff-Nanosuspensionen durch die Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein In-vitro-Modell der Blut- Hirn-Schranke etabliert. Die Kokultur von primären Ratten-Hirnendothelzellen mit primären Rattenastrozyten in einem Transwell-System war der Monokultur von unterschiedlichen Zellinien aus Maus oder Ratte überlegen. Sowohl die Messung des TEER (bis zu 350 Ohm x cm2) als auch die Permeabilitätsuntersuchungen bestätigten die grundsätzliche Eignung für Transportstudien. Problematisch stellte sich die Testung von mit Tween-80-beladenen Nanosuspensionen heraus, da diese selbst im zellfreien System vermutlich aufgrund von Aggregation oder Adhäsion an der Plastikoberfläche den Filter nicht dosisabhängig passierten. Um die Interaktion von T. gondii mit der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen, wurde die Infektion von primären Hirnendothelzellen der Ratte mit T. gondii mittels Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht. Parallel dazu wurden zytotoxische Effekte des Parasiten auf Hirnendothelzellen mit verschiedenen Methoden untersucht. Es zeigte sich, dass Hirnendothelzellen innerhalb weniger Minuten von T. gondii infiziert wurden; deutliche zytotoxische Effekte stellten sich erst bei Parasiten-Zell-Verhältnissen von >1:1 ein. Um die Wirksamkeit von Antiparasitika-Nanosuspensionen zu untersuchen, wurden Tween-80-beladene Nanosuspensionen des Hydronaphthochinons Atovaquon (mit exzellenter In-vitro-Wirksamkeit gegen T. gondii) für die i.v.-Therapie hergestellt. Die Dosis und Häufigkeit der Verabreichung in der Akutphase der Behandlung wurde optimiert. Dabei wurden Konzentrationen im Serum der Versuchstiere von Atovaquon erreicht, die denen im Serum von oral-behandelten Patienten entsprechen. Darüber hinaus wurde erstmals ein Mausmodell der Reaktivierungstoxoplasmose zur Testung von Wirkstoffen für die Erhaltungstherapie etabliert. In diesem Modell zeigte eine oral verabreichte Atovaquon-Suspension eine der Standard-Erhaltungstherapie (Kombination von Pyrimethamin und Sulfadiazin) überlegene Wirksamkeit. Sowohl die Überlebenszeiten der behandelten Mäuse als auch die histologischen Veränderungen im Hirn und anderen Organen belegten die ausgezeichnete Wirksamkeit der Atovaquon-Suspension. Atovaquon konnte in Serum, Leber und Lunge der behandelten Tiere mittels HPLC, im Gehirn mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertationsarbeit erlauben weiterführende detaillierte Untersuchungen zur Passage von Wirkstoffen durch die Blut-Hirn-Schranke im Kokultur-Modell. Darüber hinaus kann die Transmigration des Parasiten durch die Blut-Hirn- Schranke und die Interaktion mit Zellen der Blut-Hirn-Schranke in-vitro analysiert werden. Das Mausmodell der Reaktivierungstoxoplasmose ermöglicht in enger Anlehnung an die Situation bei immunsupprimierten Patienten die Testung des therapeutischen Effekts weiterer antiparasitärer Substanzen in der Akut- und Erhaltungstherapie. Atovaquon sollte in klinischen Studien zur Akut- und Erhaltungstherapie der Toxoplasma-Enzephalitis getestet werden.Primary infection with Toxoplasma gondii usually does not cause clinical symptoms. Infection is characterized by persistence of the parasite in cysts in the central nervous system. In immunocompromized hosts (i.e. AIDS- and transplanted patients) reactivation may occur and results in development of toxoplasmic encephalitis. Reactivation takes a lethal course if left untreated. Therapy comprises a 4-week course of acute treatment and lifelong maintenance treatment. Standard therapy regimens often cause allergy or have toxic side effects. Alternative therapy regimens show low bioavailability and/or do only poorly penetrate the blood-brain-barrier (BBB). Antiparasitic drugs prepared as nanosuspenions with modified surfaces (i.e. tween 80-coated) allow targeting of the central nervous system. To investigate the passage of antiparasitic nanosuspensions through the BBB, we established a co-culture transwell model of the BBB using primary rat brain endothelial cells and primary rat astrocytes. This co-culture model was superior to the commonly applied models using mouse or rat brain endothelial cell lines. We observed increased electrical resistance (TEER of up to 350 Ohm x cm2) as well as low paracellular permeability using sodium fluorescein as a marker. However, the passage of tween 80-coated nanosuspensions through the transwell system, was not dose dependent, most likely caised by aggregation of nanosuspensions and adherence to the polycarbonate filters was observed. To study the interaction of T. gondii tachyzoites with the BBB, we followed the infection of primary brain endothelial cells by T. gondii using laser-scanning microscopy. We observed rapid entry of the parasites into brain endothelial cells. In parasite-cell-ratios of >1:1, parasites showed dose-dependent cytotoxic effects on endothelial cells. Tween 80-coated nanosuspensions of the lipophilic hydronaphthochinone atovaquone (showing excellent in-vitro activity against T. gondii) were prepared to investigate targeting of the brain in- vivo. Dosage, time, and frequency of i.v.-administration of atovaquone nanosuspensions for acute treatment were optimized in a murine model of reactivated toxoplasmosis. In addition, we expanded the murine model of acute therapy to study the therapeutic efficacy of drugs in maintenance therapy. Oral administration of atovaquone suspensions showed superior therapeutic efficacy compared to standard therapy using the combination of pyrimethamine and sulfadiazine. Time to death was prolonged and histological signs of toxoplasmic encephalitis were absent in mice orally treated with atovaquone. High concentrations of atovaquone were detectable in sera, liver, and lungs of mice using HPLC whereas in brains of mice atovaquone was only detectable by highly sensitive mass spectrometry. Results of the present study will allow further studies to follow passage of antiparasitic drugs through the BBB. The co-culture model also allows to track transmigration of the parasite through the BBB. The murine model of reactivated toxoplasmosis closely mimics the clinical situation in immunocompromized hosts and therefore allows testing of antiparasitic drugs for acute and maintenance therapy in-vivo. Atovaquone should be further tested in clinical trials for acute and maintenance treatment of toxoplasmic encephalitis