Identification of a Protein-Interaction Network for Huntingtin and Polyglutamine-mediated Induction of Yeast Prions

Titel, Danksagung, Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Identifizierung eines Protein-Interaktionsnetzwerks für Huntingtin 21 2.1 Ergebnisse 21 2.2 Diskussion 59 3 Polyglutaminabhängige Induktion von Hefeprionen 73 3.1 Ergebnisse 73 3.2 Diskussion 108 4 Materialien und Methoden 118 4.1 Materialien 118 4.2 Methoden 133 5 Zusammenfassung 170 6 Abstract 172 7 Literaturverzeichnis 174 8 Abkürzungsverzeichnis 195 9 Publikationen 197 10 Lebenslauf 198 11 Anhang 199Chorea Huntington (HD) ist eine vererbbare, progressiv verlaufende neurodegenerative Erkrankung, die durch eine verlängerte Polyglutaminsequenz in dem Protein Huntingtin (Htt) verursacht wird. Aufgrund dieser Veränderung aggregiert mutiertes Htt und lagert sich in Form von neuronalen Einschlusskörpern im Gehirn von HD-Patienten ab. Bis heute ist weder die zelluläre Funktion von Htt, noch der Pathomechanismus von HD vollständig aufgeklärt. Da Htt mit Proteinen interagiert, die bekanntermaßen eine Rolle bei der Transkriptionsregulation, bei der Endozytose sowie bei der Signalübertragung spielen, ist wahrscheinlich, dass auch Htt an diesen Prozessen beteiligt ist. Um die Funktion von Htt weiter aufzuklären, wurde in dieser Arbeit ein Protein-Interaktionsnetzwerk für Htt mit Hilfe von Hefe Two- Hybrid cDNA-Bank- und Array-Screens erstellt. Das Htt-Netzwerk setzt sich aus 64 Proteinen, die 186 Interaktionen ausbilden, zusammen. 165 dieser Interaktionen waren bisher nicht in der Literatur beschrieben. Um die Qualität des Datensatzes zu belegen, wurden 54 Protein-Interaktionen anhand von in vitro Bindungsexperimenten überprüft und in 35 Fällen (65 %) bestätigt. Durch Y2H-Screens wurden insgesamt 19 direkte Interaktionspartner von Htt identifiziert, von denen die meisten in transkriptionale Prozesse involviert sind. Das Htt-Netzwerk gibt neue Einblicke in die Funktion von Htt und kann als Ausgangspunkt für die Untersuchung von Proteinen genutzt werden, die möglicherweise mit der Pathogenese von HD assoziiert sind. Ein neu identifizierter Interaktionspartner von Htt ist GIT1, ein mit einer G-Protein gekoppelten Rezeptor-Kinase interagierendes Protein. In vitro durchgeführte Aggregationsexperimente zeigten, dass GIT1 die Aggregation von mutiertem Htt fördert. C-terminale GIT1-Fragmente rekrutierten mutiertes Htt in vesikelartige perinukleare Strukturen, wodurch möglicherweise die Htt- Aggregation beschleunigt wird. In Gehirnen von verstorbenen HD-Patienten wurde GIT1 in den von Htt gebildeten neuronalen Einschlusskörpern nachgewiesen. Interessanterweise konnte in geschädigten Gehirngeweben von HD-Patienten kaum vollständiges GIT1 detektiert werden. Stattdessen traten dort überwiegend C-terminale GIT1-Fragmente auf. Dies deutet darauf hin, dass GIT1 bei HD proteolytisch prozessiert wird. Eine veränderte zelluläre Verteilung und eine Beeinträchtigung der Funktion von GIT1 tragen möglicherweise zur Pathogenese von HD bei. Zur Familie der neurodegenerativen Krankheiten gehören neben HD auch die Prionenerkrankungen. Diese werden durch ein einziges falsch gefaltetes Protein, dem sogenannten Prionenprotein PrP, hervorgerufen. Der Mechanismus, der zur Falschfaltung von PrP führt, ist bis heute nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Arbeit wurde die spontane Entstehung von Prionen in S. cerevisiae untersucht, da diese Hefe ein einfaches und gut etabliertes Modellsystem für die Charakterisierung von Prionen darstellt. Das Hefeprion [PSI +] entsteht durch Falschfaltung und der daraus resultierenden Aggregation des an der Translation beteiligten Terminationsfaktors Sup35. Ein besonderes Merkmal von [PSI +] ist, dass seine spontane Entstehung die Präsenz anderer Prionen wie z.B. [PIN +] voraussetzt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass [PSI +] auch unabhängig von präexistierenden Prionen induziert werden kann, wenn Sup35 mit Htt-Exon1 Fragmenten mit 54 oder 92 Glutaminen fusioniert ist. Die entsprechenden Fusionsproteine bildeten bei Expression in Hefe Aggregate und stimulierten die Aggregation von endogenem Sup35. Auch bei Expression von PrD-Htt Fusionsproteinen, die aus der N-terminale Domäne von Sup35 und Htt-Exon1 Fragmenten mit 54 oder 92 Glutaminen bestehen, wurde der [PSI +]-Phänotyp induziert. Die Effizienz der de novo Induktion von [PSI +] war sowohl von der Polyglutaminlänge als auch von der Aggregationsgeschwindigkeit der Fusionsproteine abhängig. Die Beobachtung, dass der durch Expression von Sup-Htt entstandene [PSI +] Phänotyp, auch nach Verlust der für die Fusionsproteine kodierenden Plasmide stabil von der Mutter- auf die Tochterzelle vererbt wird, weist darauf hin, dass Sup-Htt Aggregate nur für die de novo Entstehung nicht aber für die Vererbung von [PSI +] erforderlich sind. In Übereinstimmung mit den in vivo Daten zeigten in vitro Versuche mit aufgereinigten Proteinen, dass PrD-Htt Fusionsproteine spontan amyloidartige Fibrillen bilden und dass diese Aggregate die Polymerisation von aufgereinigtem löslichen Sup35-Protein initiieren können. Die polyglutaminabhängige de novo Induktion des Hefeprions [PIN +] zeigt, dass sich durch die Fusion mit aggregationsfördernden Polyglutaminsequenzen auch andere Prionen erzeugen lassen. Somit weisen die hier präsentierten Ergebnisse darauf hin, dass die spontane Aggregation des löslichen Prionenäquivalents die molekulare Basis für die Entstehung von Hefeprionen ist.Huntington´s Disease (HD) is an inherited, progressive neurodegenerative disorder caused by an elongated polyglutamine stretch in the protein huntingtin (htt). The prolonged polyglutamine sequence triggers aggregation of mutant htt and causes the formation of neuronal inclusions in HD patient brains. Neither the cellular function of htt nor the pathomechanism of HD are currently known. Because of its interactions with a variety of characterized proteins, htt is believed to be involved in different cellular processes including transcription, endocytosis and cell signaling. To further investigate the function of htt, this study placed htt in a comprehensive network of protein interactions. The network was generated from data obtained by yeast two-hybrid (Y2H) cDNA-library and array screens. The htt network includes 186 physical interactions among 64 proteins. 165 of these interactions have not been described before. To evaluate the quality of the Y2H data, 54 interactions were tested by in vitro binding experiments and 35 interactions (65 %) were confirmed. In total 19 direct interaction partners of htt were identified by Y2H screens, most of which were associated with transcriptional regulation. The HD network provides additional clues to htt function and moreover is a valuable starting point to identify proteins involved in HD pathogenesis. An important novel interaction partner of htt identified in this study is GIT1, a G protein-coupled receptor kinase- interacting protein. In vitro aggregation experiments have shown that GIT1 is crucial for htt aggregation. Moreover, C-terminal GIT1 fragments recruit mutant htt into vesicle-like perinuclear structures which probably is the mechanism underlying GIT1-mediated enhancement of htt aggregation. Immunohistochemical studies revealed that GIT1 is present in neuronal inclusions that typically appear in the brain of HD patients. Furthermore, a reduced amount of full-length GIT1 was observed in the brains of diseased patients while significant amounts of C-terminal GIT1 fragments were found to be accumulated. These findings suggest that during progression of HD GIT1 is processed. An abnormal cellular distribution and function of GIT1 may contribute to HD pathogenesis. Like HD, also the prion diseases belong to the family of neurodegenerative disorders. Prion diseases result from the misfolding of a single protein, the prion protein PrP. The mechanisms leading to misfolding of PrP and to toxicity are unclear. In this study the spontaneous appearance of prions in the yeast S. cerevisiae was investigated. Yeast is as a simple and well-established model system for studying the properties of prions. The yeast prion [PSI +] results from misfolding and aggregation of the translation termination factor Sup35. The spontaneous appearance of [PSI +] requires the presence of other prions such as [PIN +]. This study shows that [PSI +] can form spontaneously in the absence of pre- existing prions, when the intrinsic propensity of Sup35 to form aggregates is enhanced by the addition of aggregation-prone htt exon1 fragments containing 54 or 92 glutamines. Expression of the Sup-htt fusion proteins led to the accumulation of aggregates and stimulated the conversion of endogenous Sup35 from the soluble into the insoluble state. Likewise expression of PrD-Htt fusion proteins consisting of N-terminal Sup35 and htt exon1 fragments formed aggregates and induced [PSI +]. The efficiency of the de novo appearance of [PSI +] was dependent on the length of the polyglutamine expansion and the aggregation rate of the fusion proteins. Once acquired, the [PSI +] state was stably transmitted from mother to daughter cells even upon loss of the Sup-htt fusion proteins, indicating that Sup-htt aggregates are required for induction but not for propagation of [PSI +]. In line with the in vivo data, in vitro studies revealed that purified PrD-htt fusion proteins spontaneously assemble into amyloid-like fibers which in turn initiate the polymerisation of purified soluble Sup35. The polyglutamine-dependent induction of the prion [PIN +] in the absence of pre-existing prions supports the hypothesis that also other prions can be induced by the addition of polyglutamine tracts. Thus, the presented data suggest that spontaneous aggregation of the nonprion protein is the molecular basis for the de novo appearance of yeast prions