Synthesis and testing of new active compounds with higher affinity to the nuclear estrogen receptor and high adsorption capacity on surfaces of hormone dependent tumor cells

Bivalente meso-4,5-Diaryl-2-imidazolin Dihydrochloride unter anderem mit den Substitutionsmustern 2-Halo-4-hydroxy, 4-Hydroxy und 4-Fluor am Aromaten wurden synthetisiert. Hierbei wurden Alkylspacer der Kettenlänge n = 4-10 gewählt. Nach einer modifizierten Synthese nach Vögtle und Goldschmitt wurden die entsprechend substituierten meso-1,2-Diarylethylendiamine erhalten und diese mit Diiminodiethylester Dihydrochloriden verschiedener Kettenlänge (n = 4-10) zu den entsprechenden bivalenten meso-4,5-Diaryl-2-imidazolin Dihydrochloride umgesetzt. Außerdem konnte das Monomer meso-4,5-Bis(2,6-dichlor-4-hydroxyphenyl)-2-imidazolin Hydrochlorid synthetisiert werden. 2-Halo-4-hydroxy substituierte Verbindungen wurden auf ihre Zytotoxizität und Affinität zum ERalpha und beta untersucht. Die Substanzen mit einer 2-Fluor-4-hydroxy-Substitution zeigten keine zytotoxischen oder am ER agonistischen/antagonistischen Eigenschaften. Alle bivalenten 2-Chlor-4-hydroxy-2-imidazolin Dihydrochloride wirkten nicht wachstumshemmend auf hormonabhängige MCF-7 Mammakarzinom-Zellen. An U2OS/alpha- und U2OS/beta-Zellen konnte gezeigt werden, dass Dimere analog ihren Monomeren keine bessere Affinität zum ERalpha beziehungsweise beta hatten. Nur das C4-Analogon war in der Lage, die Luciferase-Expression zu aktivieren. Eine Antiestrogenität wurde nicht beobachtet. Interessanterweise hatten diese dimeren Verbindungen Einfluss auf die ERalpha- Dichte in MCF-7- Zellen. Das C4-Analogon stimulierte die Dichte. Bei einer Konzentration von 1 und 10 µM konnten aber die weiteren Verbindungen die Rezeptordichte um knapp 65 % verringern. Keine dieser Testverbindungen zeigte eine Bindungsaffinität zu den ER-Subtypen. Einzig das 2,6-Dichlor-4-hydroxy substituierte Monomer zeigte eine beachtliche Wirksamkeit an U2OS-Zellen. Bei 3.88•10-9 bzw. 4.7•10-10 M an beiden Subtypen konnte eine 50 %ige Luciferase-Expression bezogen auf den natürlichen Liganden 17beta-Estradiol festgestellt werden. Damit war diese Verbindung der in dieser Arbeit erhaltene stärkste Agonist an beiden ER-Subtypen. Dimere mit 4-Hydroxy-Substituenten am Aromaten sind inaktiv. Eine antiproliferative Wirkung an MCF-7- Zellen konnte auch bei einer Konzentration von über 20 µM nicht beobachtet werden. Durch das Fehlen von Halogensubstituenten in ortho-Stellung verlieren sie ihre Affinität zum ERalpha beziehungsweise ERbeta. Mit 4-Fluor substituierte Dimere wurden auf ihre Zytotoxizität und Zellaufnahme an hormonabhängigen MCF-7 Mammakarzinom- Zellen untersucht. Diese wirken stark zytotoxisch. Ihre IC50-Werte liegen im oberen nanomolaren Bereich [IC50: 60 (630 nM) > 61 (430 nM) > 62 (260 nM) > 63 (240 nM)]. Mit steigender Kettenlänge nimmt dieser Effekt zu. Er korreliert mit einer sehr starken zellulären Anreicherung. Das monomere 2-Imidazolin mit der Fluor-Substitution in para- Position am Aromaten dagegen ist weder zytotoxisch noch wird es ausgeprägt in der Zelle angereichert. Verfolgt wurden die zelluläre Anreicherung mit einer neu entwickelten Methode, der High- Resolution Continuum Source Atomabsorptionsspektroskopie. Ein Anreicherungsgrad von 219 kann bei 61 nach 60 Minuten Inkubation der Zellen mit 2 µM beobachtet werden. Mit steigender Kettenlänge nimmt die Zellaufnahme dieser Verbindungen weiter zu. Bei gleicher Inkubationszeit und Konzentration erhöht sie sich bei 62 bereits auf einen Anreicherungsgrad von 275. 63 zeigt sogar bereits nach 40 Minuten einen Anreicherungsgrad auf 412. Allerdings konnte nicht mehr geklärt werden, ob die hohen Anreicherungsgrade intrazellulärer Natur sind oder ob sie sich auf der Zelloberfläche anreichern. Da kein pharmakologisches Testsystem für den membranständigen GPR30-Rezeptor vorhanden war, konnte seine Beteiligung an der Zellaufnahme nicht nachgewiesen werden. Einen möglichen Hinweis auf intrazelluläre Anreicherung lieferten aber Untersuchungen mit Zellaufnahmehemmern. Nur in Anwesenheit von Methyl-beta- Cyclodextrin (M-beta-CD) konnte eine starke Verringerung der Zellaufnahme der untersuchten C10-Verbindung beobachtet werden. Die intrazelluläre Fluorkonzentration konnte bis fast auf die Hälfte des Kontrollwertes auf 56 % reduziert werden. Der Einfluss des M-beta-CD deutet womöglich auf eine Caveolin vermittelte Endozytose der Verbindungen hin. Einige ausgewählte dimere Verbindungen wurden auf ihre Stabilität in PBS (pH = 7.4, 37 °C) untersucht. Die genannten Verbindungen sind über den gesamten Zeitraum von 96 Stunden stabil und liegen im Zellmedium alle gelöst vor. Ihre Sättigungslöslichkeiten liegen zwischen 190-670 µM, die pKs-Werte bei 9, so dass sie zu 97.61 % protoniert im Zellmedium (pH = 7.4) vorliegen. N-alkylierte Monomere zeigten in vorherigen Arbeiten gegenüber unsubstituierten und C2-alkylierten 2-Imidazolinen eine Steigerung ihrer agonistischen Wirkungen an ERalpha und beta. Untersuchungen ihrer Dimere an U2OS-Zellen auf mögliche Luciferase-Expression, als auch Molecular Modeling Studien zur Klärung der Interaktionen mit dem Estrogenrezeptor scheinen daher interessant zu sein und können noch einen Ansatzpunkt für weitere Forschungen sein.Bivalent meso-4,5-diaryl-2-imidazoline dihydrochlorides were synthesized among others with 2-halo-4-hydroxy, 4-hydroxy and 4-fluorine substitution. Alkyl spacers with a chain length of n = 4-10 have been attached. Through a modified synthesis soon to be published by Vögtle and Goldschmitt meso-1,2-diarylethylenediamines, which were substituted accordingly, were obtained and converted with diiminodiethyl esters dihydrochlorides into bivalent meso-4,5-diaryl-2-imidazoline dihydrochlorides with various chain lengths (n = 4-10). Furthermore, the monomer meso-4,5-bis(2,6-dichloro-4-hydroxyphenyl)-2-imidazoline hydrochloride has been synthesized. 2-Halo-4-hydroxy substituted organic compounds have been tested for affinity at ERalpha, beta and cytotoxicity. Compounds with 2-fluoro-4-hydroxy substitution showed neither cytotoxic nor agonistic/antagonistic effects on the ER. All bivalent 2-chloro-4-hydroxy-2-imidazoline dihydrochloride caused no anti-proliferative effect on hormone dependent MCF-7 mammary carcinoma cells. Using U2OS/alpha- and U2OS/beta-cells the interactions of the dimers with the ERalpha, beta are similar to their analogues monomers. Only the C4-analogue activated luciferase expression. Anti-estrogenity had not been observed. Interestingly this bivalent compounds influenced ERalpha-density in MCF-7 mammary carcinoma cells. The C4-analogue stimulated the density. Other compounds reduced the receptor density about 65 % at concentrations of 1 and 10 µM. None of the tested compounds have a binding affinity to either one of the ER subtypes. Only the 2,6-dichloro-4-hydroxy substituted monomer showed considerable effect on U2OS cells. A luciferase expression of 50 % referred to the natural ligand 17beta-estradiol has been ascertained at the two subtypes at concentrations of 3.88•10-9 M as well as 4.7•10-10 M. This compound showed the strongest agonistic effect in this work. 4-Hydroxy substituted compounds were inactive. Antiproliferative effects on MCF-7 cells could not be observed even at concentrations above 20 µM. The absence of a halogen substituent in the ortho position causes them a loss of ERalpha, beta affinity. 4-Fluorine substituted dimers were investigated for cytotoxicity and cell uptake at hormone dependent MCF-7 mammary carcinoma cells. They showed strong cytotoxic effects. Their IC50-values are in an upper nanomolar range [IC50: 60 (630 nM) > 61 (430 nM) > 62 (260 nM) > 63 (240 nM)]. With rising chain length this effect increased. This correlates with a very strong cellular accumulation. The 2-imidazoline monomer with fluorine substitution in para position however showed neither cytotoxic effect nor a high cellular uptake. The cellular enrichment was assessed with a new-developed method, the high resolution continuum source atom absorption spectroscopy. An accumulation grade of 219 could be observed with compound 61 after 60 minutes incubation of the cells with 2 µM. The effect becomes more potent with rising chain length. After the same incubation time for compound 62 cell admission increased an accumulation grade of 275. Furthermore an accumulation grade of 412 has been observed for compound 63 after 40 minutes of incubation. Nevertheless, it has not become clear whether the high degrees of enrichment are intracellular or whether they accumulate only on the cell membrane. Because no pharmacological test system of the membrane bounded GPR30 receptor exists, the participation in the cell admission could not be proven so far. However, one possible evidence on intracellular enrichment can be delivered through investigations with cellular uptake inhibitors. In presence of methyl-beta-cyclodextrine (M-beta-CD) a strong reduction of cell admission of the C10-compound could be observed. The intracellular fluorine concentration has been reduced to 56 % which is almost half of the control value. The influence of M-beta-CD might indicate a caveolin-depended endocytosis of this substance. Some selected dimers were tested for stability in PBS (pH = 7.4, 37 °C). They showed a good stability over 96 hours and can be found soluted in the cell medium. Its saturation solubility was between 190-670 µM. Their pKa values equal approximately 9, so that they are protonated in thee cell medium to 97.61 % (pH = 7.4). Previous works documented that monomers with N-alkylation compared to unsubstituted and C2-alkylated 2-imidazolines increase their agonistic effects on ER subtypes. Hence, investigations of their dimers at U2OS cells for possible luciferase expression and molecular modeling studies for clarification interactions with the estrogen receptor seem to be interesting for possible luciferase expression