Effects of different feed additives on a porcine intestinal epitelial cell line (IPEC-J2) and on the immune system of piglets after PRRSV vaccination

1\. EINLEITUNG 1 2\. LITERATUR 2 2.1. Bedeutung von Futterzusatzstoffen und anderen Substanzen als Ersatz für antibiotische Leistungsförderer zur Sicherung der Schweinegesundheit 2 2.1.1. Schweinehaltung als Wirtschaftsfaktor 2 2.1.2. Antibiotikaeinsatz in der Tierhaltung 2 2.2. Einsatz von natürlichen Futterzusatzstoffen als Ersatz für antibiotische Leistungsförderer und deren Wirkung auf die Schweinegesundheit 3 2.2.1. Antimikrobielle Effekte von natürlichen Futterzusatzstoffen 3 2.2.2. Ernährungsphysiologische Effekte von natürlichen Futterzusatzstoffen 6 2.2.3. Immunstimulierende Effekte von natürlichen Futterzusatzstoffen 8 2.3. Escherichia coli als Durchfallerreger beim Schwein 10 2.4. Darmassoziiertes Immunsystem des Ferkels 12 2.4.1. Aufbau des Immunsystems 12 2.4.2. Immunphänotypische Einteilung der Zellen 15 2.5. Porzines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom (PRRS, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) 19 2.5.1. Ätiologie und Pathogenese des PRRS 19 2.5.2. Immunreaktion auf eine PRRSV Infektion 20 2.5.3. PRRSV Impfung 22 2.6. IPEC-J2 Zellen 24 2.6.1. Morphologie, Gen- und und Proteinexpression 24 2.6.2. Verwendung als Infektionsmodell 30 2.7. Ziel der Arbeit 32 3\. MATERIAL UND METHODEN 33 3.1. In vitro Untersuchungen 33 3.1.1. Einfluss der Testsubstanzen auf den TEER 39 3.1.2. Einfluss der Testsubstanzen auf die Interaktion zwischen E. coli und dem TEER einer IPEC-J2 Zelllinie 40 3.2. Fütterungsversuch 41 3.2.1. Tierexperimentelle Methoden 41 3.2.2. Futtermitteluntersuchung 45 3.2.3. Bestimmung der Rohnährstoffe (Weender Analyse) 46 3.2.4. Mineralstoffbestimmung 47 3.2.5. Versuchsdurchführung 48 3.2.6. Immunologische Methoden 50 3.3. Statistische Auswertung 62 4\. ERGEBNISSE 63 4.1. In vitro Untersuchungen 63 4.1.1. Einfluss auf die Interaktion zwischen einem enterotoxischen E. coli Stamm und einer IPEC-J2 Zelllinie mittels Bestimmung des TEER 63 4.1.2. Einfluss von Extrakten auf den Transepithelialen Elektrischen Widerstand (TEER) einer IPEC-J2 Zelllinie 64 4.1.3. Einfluss der Testsubstrate (6 und 24h Einwirkzeit) auf die zelluläre Interaktion zwischen einem enterotoxischen E. coli Stamm und einer IPEC J2 Zelllinie mit Bestimmung des TEER 66 4.2. Fütterungsversuch 67 4.2.1. Leistungsparameter 67 4.2.2. Hämatologische und immunologische Parameter 69 5\. DISKUSSION 76 5.1. Kritik der Methoden 76 5.1.1. In vitro Untersuchungen 76 5.1.2. In vivo Untersuchungen 81 5.2. In vitro Untersuchungen 83 5.2.1.Einfluss der biologischen Substanzen auf die Adhäsion eines enteropathogen E. coli Stammes auf eine IPEC-J2 Zelllinie 83 5.3. Fütterungsversuch 88 5.3.1. Hämatologische und immunologische Parameter 90 6\. PERSPEKTIVE 94 7\. ZUSAMMENFASSUNG 95 8\. SUMMARY 97 LITERATURVERZEICHNIS 99 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 129 TABELLENVERZEICHNIS 132 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 137 ANHANG 140 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 145Untersuchungen haben gezeigt, dass Futterzusatzstoffe effektiv zur Reduzierung von Durchfallerkrankungen, die von pathogenen Escherichia coli bei Absetzferkeln ausgelöst werden, eingesetzt werden können. Die intestinale porzine Epithelzelllinie IPEC-J2 wurde als ein in vitro Modell eingesetzt, um die Wirkung von Futterzusatzstoffen auf die Adhäsion sowie die zelltoxischen Effekte eines F4-positiven E. coli Stamms (ETEC, Abbotstown) zu bestimmen. Ein nicht pathogender Stamm (DSM 2840) wurde herangezogen, um den F4-Fimbrien Einfluss zu testen. Die Charakterisierung der Epithelkonfluenz wurde durch die Messung des Transepithelialen Elektrischen Widerstandes (TEER) von IPEC-J2 Zellen erhoben. Die zu untersuchenden Futterzusatzstoffe wurden als wassserlösliche Extrakte in verschiedenen Verdünnungen und Inkubationszeiten (6 und 24 Stunden) eingesetzt. Die erfolgreiche Anbindung des F4 positiven E. coli Stamms an das IPEC-J2 Epithel führte bereits kurz nach der in vitro Infektion zu einer Reduzierung des TEER. Im Gegensatz dazu zeigte der Stamm DSM 2840 keine Veränderung des TEER. Die Extrakte von einer Säurenmischung (AM), Rinderkolostrum (CM), Ananasstammextrakt, gemahlenen und getrockneten Kernobststeinen (DS), Thymian (TY) und Hefezellwandbestandteilen von Saccharomyces cerevisiae (PV) übten keine positiven Effekte auf das IPEC-J2 Epithel aus. Die Verringerung des Widerstandes nach der der ETEC-Infektion war in allen Versuchsgruppen vergleichbar und wurde durch die Zugabe der einzelnen Substanzen nicht beeinflusst. In einem nächsten Schritt wurde die Immunantwort von Ferkeln auf eine Impfung gegen PRRSV untersucht, nachdem verschiedene Futtermittelzusatzstoffe eingesetzt wurden. In dem Tierversuch wurden über die Dauer von 39 Tagen in fünf Gruppen je zehn abgesetzte Ferkel im Alter von drei Wochen eingesetzt. Die unterschiedlichen Versuchsgruppen beeinhalteten eine autolisierte Hefepräparation (PV), getrocknete und gemahlene Kernobststeine (DS), Rinderkolostrum (CM) oder einen probiotischen Bacillus cereus var. Toyoi NCIMB 40112 als Zusatz. Die Ferkel wurden eine Woche nach der Einstallung im Alter von drei Wochen gegen PRRSV geimpft. Dabei wurden Blutproben vor der Impfung sowie 7, 21 und 35 Tage nach der Impfung entnommen, um das Blutbild zu bestimmen und die Immunzellen mittels Durchflusszytometrie zu phänotypisieren. Zusätzlich wurden die spezifischen IgG Antikörpertiter bestimmt und ein ELISpot Assay etabliert, um spezifische Interferon-γ produzierende Lymphozyten detektieren zu können. Die Leistungsparamter wurden durch die einzelnen Diäten nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu zeigten die hämatologischen Parameter und das Gesamtblutbild altersabhängige Veränderungen. Fütterungsbedingte Effekte konnten nicht aufgezeigt werden. Die Analyse der Lymphozytenoberflächenmarker wiesen deutliche zeitabhängige Veränderungen, aber keine diätbedingten Effekte auf. Die CD4-CD8α+ Zellen erreichten ihre höchste Zahl 21 Tage nach der Impfung, um anschließend wieder abzusinken (P = 0,007). Die CD2+CD5- Zellen nahmen in allen Gruppen bis zum Tag 35 stetig ab (P < 0,001). Die CD2+CD5+ Zellen verblieben während des gesamten Beobachtungszeitraums konstant, während die Anzahl der CD2-CD5+ und CD4+CD8α- Zellen über die Zeit abfielen (P = 0,07, P < 0,001). Die CD4+CD8α+ doppelt positiven Zellen stiegen in allen Gruppen altersbedingt an (P = 0,001). Die CD21+ Zellen und CD14+ Zellen wurden nur teilweise durch das Alter beeinflusst. Zunehmende spezifische IgG-Titer wurden im Versuchszeitraum bestimmt (P < 0,001). Gruppenspezifische Effekte konnten jedoch, ähnlich wie bei den INF-γ produzierenden T Zellen, nicht nachgewiesen werden. Die Immunsystementwicklung bei Ferkeln scheint somit typischen zeitabhängigen Mustern zu folgen. Fehlende fütterungsbedingte Effekte auf die Immunantwort könnten in diesem Versuch auf die ausgewogene Ernährung und die guten sanitären Bedingungen begründet werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass mithilfe der TEER-Messmethode der schädigende Einfluss auf das Epithel und die Zellintegrität, ausgelöst durch eine F4 positive ETEC- Anbindung an IPEC-J2 Zellen, dargestellt werden konnte. Somit könnte das Zellkulturmodell zusammen mit der TEER-Messmethode ergänzend zu in vivo Infektionsversuchen mit Ferkeln als Screening-Tool eingesetzt werden. Die Wirksamkeit der Futterzusätze im Tier könnte sich unter anderen Bedingungen, z.B. weniger guter Haltungshygiene, anders darstellen als in vorliegendem Versuch.Feed additives have been shown to be effective in reducing the incidence of post weaning diarrhea caused by pathogenic Escherichia coli in piglets. The intestinal porcine epithelial cell line IPEC-J2 was used as an in vitro model to assess effects of additives on the adhesion and cell toxic effects of a F4 positive E. coli strain (ETEC, Abbotstown). A non pathogenic strain (DSM 2840) was used to determine the impact of F4 fimbria. The confluence of the epithelium was characterized by measurement of transepithelial electrical resistance (TEER) of the IPEC-J2 cells. The feed additives were prepared as aqueous extract and tested in different dilutions and incubation times (6h and 24h). The F4 positive E. coli strain adhered to IPEC-J2 cells and reduced TEER shortly after in vitro infection. The strain DSM 2840 showed no TEER impairment. Extracts from organic acid mix (AM), bovine colostrum (CM), pineapple stems (BM), drupe stones (DS), a phytogenic product with thyme (TY) and yeast preparations of Saccharomyces cerevisiae (PV) had no positive effects on the IPEC-J2 epithelium. The TEER decrease after ETEC infection was in a comparable level and was not affected by the added substances. The cell culture model might be suitable as screening tool, to complement in vivo challenge trials with piglets. The immune response of piglets to a vaccination against the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) was tested after feeding different feed additives. The trial included five groups of ten piglets and lasted 39 days. Feed additives were added to a control diet (C). Tested substances included an autolyzed yeast preparation from Saccharomyces cerevisiae (PV), dried and milled drupe stones (DS), dried bovine colostrum (CM) and the probiotic B. cereus var. Toyoi. Three-week-old piglets were vaccinated against PRRS-Virus, blood samples were taken before vaccination and 7, 21, and 35 days after vaccination for complete blood counts, flow cytometry for immune cell phenotyping, measurement of specific IgG antibodies and ELISpot assay to detect specific interferon γ-producing lymphocytes. Animal performance was not affected by the experimental diets. Hematological parameters and complete blood counts displayed time-dependent changes, feed-related effects were not observed. The analysis of the expressed lymphocyte surface markers showed distinct time dependent shifts but no dietary effects. CD4-CD8α+ cells reached highest levels on day 21 post vaccination and decreased thereafter (P = 0.007), the CD2+CD5- cells decreased in all groups towards day 35 (P < 0.001). CD2+CD5+ cells were determined at constant levels during the observation period, while CD2-CD5+ cells increased and CD4+CD8α- cells decreased over time (P = 0.07, P < 0.001). CD4+CD8α+ double positive cells increased age-dependently in all groups (P = 0.001). CD21+ cells and CD14+ cells were only partially affected by age. Increasing levels of specific IgG were determined (P < 0.001), but group effects could not be demonstrated as for the interferon γ producing T cells. The development of the immune system in piglets seems to follow a typical time-dependent pattern, the lack of dietary effects on the immune response in this trial might be due to a balanced diet and appropriate sanitary conditions. In conclusion, the destructing effect on cell integrity of IPEC-J2 cells by F4-positive ETEC could be demonstrated by using TEER measurements. Consequently, the cell culture model might be suitable as screening tool complementing in vivo trials with piglets. The efficiency of feed additives in animals have to be interpreted carefully, as under different conditions, e.g. impaired hygiene, results might be different compared to the present experiment