Aetiological role of Prototheca zopfii genotype 2 in bovine Prototheca mastitis

Bei der Protothekenmastitis des Rindes handelt es sich um eine Euterinfektion mit chlorophyllosen Grünalgen, die weltweit auftritt und bisher therapieresistent ist. Bis dato wird im Schrifttum als Erreger dieser Infektionskrankheit die Spezies Prototheca (P.) zopfii angeführt. Die taxonomische Einordnung der Spezies P. zopfii war in den letzten Jahren jedoch großen Veränderungen unterworfen: Aus den im Jahre 1985 benannten drei „Varianten“ von P. zopfii gingen im Jahre 2006 bei der genetischen Differenzierung die beiden Genotypen P. zopfii Genotyp 1 und P. zopfii Genotyp 2 sowie die neue Spezies P. blaschkeae hervor. Ziel dieser Arbeit war es, das eigentliche ätiologische Agens der Protothekenmastitis des Rindes zu identifizieren und Wissenszuwächse hinsichtlich der Ätiopathogenese dieser Krankheit zu erlangen. Hierfür wurde ein in vivo Mastitis-Infektionsmodell entwickelt und an sieben Rindern wurden die Erreger-Wirt- Interaktionen über einen Zeitraum von drei Wochen nach experimenteller Infektion beobachtet. Die durchgeführten Untersuchungen umfassten die klinische Beobachtung der Tiere, die qualitative und quantitative Erregerausscheidung über die Milch und Fäzes, die Beobachtung der Veränderungen zahlreicher Parameter des Milchsekrets und des Blutes und eine umfassende mikrobiologische und pathohistologische Untersuchung der bei der Sektion der Versuchstiere gewonnenen Proben. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass lediglich die Infektion der Euterviertel mit P. zopfii Genotyp 2 zur Ausbildung einer klinischen Mastitis führte. Hierbei waren die mit diesem Erreger infizierten Euterviertel in allen Fällen diffus verhärtet, stark vergrößert und die Tagesmilchleistung sank auf weniger als die Hälfte ab. Auch die Ausscheidung der Erreger über die Milch war bei den mit P. zopfii Genotyp 2 infizierten Vierteln sehr viel stärker als bei den mit P. zopfii Genotyp 1 und P. blaschkeae infizierten Vierteln. Über die Fäzes hingegen wurden zu keinem Zeitpunkt Prototheken ausgeschieden und die Veränderungen des Blutbildes waren bei allen Versuchstieren nur minimal. Mittels indirektem ELISA konnte im Milchserum der infizierten Tiere gezeigt werden, dass gegen P. zopfii Genotyp 2 gerichtete Antikörper in sehr viel höherem Maße gebildet wurden, als gegen die zwei anderen Erreger. Auch bei den post mortem entnommenen Gewebeproben setzten sich die Ergebnisse der mit P. zopfii Genotyp 2 infizierten Viertel deutlich gegenüber der zwei anderen Erreger ab: Nur der Genotyp 2 von P. zopfii konnte außerhalb des Euters nachgewiesen werden. Pathohistologisch wiesen die Gewebeschnitte der mit P. zopfii Genotyp 2 infizierten Euterviertel stets pyogranulomatöse entzündliche Veränderungen auf, während bei den mit P. zopfii Genotyp 1 infizierten Vierteln keinerlei Anzeichen einer Mastitis gefunden wurden. Die experimentelle Infektion mit P. blaschkeae jedoch induzierte bei den Versuchstieren sehr unterschiedliche Arten und Ausprägungen von Entzündungszeichen. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass P. zopfii Genotyp 2 als der Erreger der klinischen Protothekenmastitis des Rindes anzusehen ist. Der Genotyp 1 von P. zopfii hingegen scheint ubiquitär und apathogen zu sein, während P. blaschkeae eine Rolle als Auslöser subklinischer Mastitiden zuzukommen scheint.Bovine Prototheca mastitis is an infection of the udder caused by a type of green alga that lacks chlorophyll. The disease occurs worldwide and cannot be cured. Up to this time the species Prototheca (P.) zopfii was said to be the causative agent of this infectious disease. However, the classification of the genus Prothotheca has undergone considerable changes in the last couple of years. In 1985 P. zopfii was subclassified into three so called variants. By the use of genetic differentiation these variants were reclassified as P. zopfii genotype 1, P. zopfii genotype 2 and a new species P. blaschkeae. The aim of this study was the identification of the actual etiological agent of Prototheca mastitis and to increase the level of knowledge concerning the ethiopathogenesis of this disease. Thus a mastitis infection model in cattle was developed with the aim of monitoring the host-pathogen interaction during a period of three weeks after experimental infection. The tests and assays which were performed daily included physical examination of the seven test animals, determination of shedding of the agent in milk and faeces and several milk parameters were investigated as well. In addition blood samples were taken regularly for analysis. At the end of the experimental period the animals were dissected and the collected tissue samples analyzed microbiologically and histopathologically. The results obtained in this study showed that only those quarters of an udder which were infected with P. zopfii genotype 2 developed signs of clinical mastitis. Affected quarters were hard, presented diffused swelling and the quarter milk yield was reduced by more than half. Shedding of the agent in milk was also strikingly higher in quarters infected with P. zopfii genotype 2 compared to those infected with P. zopfii genotype 1 and P. blaschkeae. At no time had there been any shedding of Prototheca spp. in faeces and changes in blood count were marginal in all cows. By using an indirect ELISA on whey it was demonstrated that antibodies against P. zopfii genotype 2 were produced at a much higher number than antibodies against P. zopfii genotype 1 and P. blaschkeae. The results of the examination of the tissue samples also revealed a major difference between the three infectious agents investigated in this study: Only P. zopfii genotype 2 could be found outside the udder. Histopathological findings in tissue sections obtained from quarters that had been infected with P. zopfii genotype 2 always included inflammatory changes with a pyogranulomatous character, whereas inoculation with P. zopfii genotype 1 did not cause any signs of inflammation. Experimental infection with P. blaschkeae lead not only to different types but also to varying intensities of inflammation. The results of the present study prove P. zopfii genotype 2 to be the causative agent of clinical Prototheca mastitis in cattle. P. zopfii genotype 1 seems to be an ubiquitous and non-pathogenic agent, whereas P. blaschkeae seems to have the ability to cause subclinical mastitis