Entzündungshemmender dendritischer Polyglycerol Sulfat Nanopartikel: Bioverteilung, Ausscheidung, zelluläre Lokalisierung und Toxikopathologie bei Mäusen

The prefix “nano” refers to any material smaller than 100 nm in one dimension. Materials with all dimensions in the nanoscale are defined as nanoparticles (NPs). At this dimension quantum effects unfold and nanomaterials (NMs) show an enhanced reactivity due to their high area-to-mass ratio. Many opportunities for innovations in industry and biomedicine originate from the unique features of NMs. In biomedicine their applications include medical devices, in vitro and in vivo diagnostics, drug delivery and therapeutics. A promising NP for different biomedical applications, in which the most prominent are the diagnosis and therapy of inflammation, is the dendritic polyglycerol sulfate (dPGS). However, the unique features of NMs can also lead to unforeseeable behaviour and may bear safety risks. Problems in risk management of NMs are in particular the missing consensus and availability of methods adequate for safety testing. Furthermore, to date specific regulatory guidance has been released for only a few NMs. The vast majority of NMs are regulated in preclinical approval like “regular” small drugs in accordance with the guidance document M3(R2) of the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. With reference to M3(R2), preclinical drug approval includes pharmacology, toxicokinetics and pharmacokinetics as well as toxicity studies. Yet further parameters, related to the unique features of NMs, such as particle size or aggregation effects, may be needed for risk assessment. Moreover, standard tests can interfere with NMs and require verification. The study presented here surveys the kinetics as well as the acute and subacute toxicopathology of dPGS and thus contributes to providing a basis for further research with a view towards drug approval. In previous in vivo efficacy studies fluorescently labelled dPGS showed no obvious acute adverse effects. The assessment of dPGS for biomedical applicability has so far been promising, but no systematically surveyed data regarding the distribution, elimination and histopathology of healthy animals, as common determinants in preclinical safety assessment, were available. Furthermore, fluorescent labelling is thought to alter NP properties leading to a different biodistribution, and hence requires verification. In addition, fluorescent labelling does not allow for histopathological evaluation. Techniques feasible to trace “soft” NPs such as dPGS in vivo are, however, limited. Due to their small size, all NPs escape the wavelength of light and require labelling for light microscopy, while the low atomic number of “soft” NPs also rules out electron microscopy. There are innovative methods, such as Raman microspectroscopy, which do not require labelling and allow NPs to be localised in cells and enable cellular alterations to be evaluated, but have the disadvantage of being technically demanding and not widely available. An alternative to labelling with fluorophores is labelling with radioisotopes. Provided the isotope is well integrated, the chemical structure of the NP is preserved. The radiation can be recorded by whole body/organ autoradiography (WBA/WOA), but can also be used for quantitative kinetic studies employing quantitative whole body/organ autoradioluminography (QWBA/QWOA) or liquid scintillation counting (LSC). Yet, these techniques only provide data on tissue level. To detect radioactively labelled NPs in cells, the light microscopic autoradiography (LMA) was established in this study. LMA also allows for concurrent histopathological analysis. The radioisotope 35S was incorporated into the dPGS NP specifically for this study. This isotope was particularly suitable because sulfur is a constituent of dPGS. It should be noted that amino functions were integrated for easy conjugation with a drug or dye. The resulting radioactive dPG35S amine was administered i.v. or s.c. to healthy mice. The mice were sacrificed but not exsanguinated at different time points following application, and samples were collected for LSC or autoradiography (WOA, QWOA, and LMA). The dPG35S amine concentration in liver and spleen increased up to 5 and 21 days following i.v. application respectively. Evaluation of tissue sections with LMA localised dPG35S amine in the Kupffer cells of the liver and in the red pulp of the spleen 24 hours, 5 and 21 days post dose. In other organs such as the kidney, lung, intestine, testes, and brain the overall dPG35S amine concentration decreased over time. Only low concentrations were measured in the testes and marginal concentrations in the brain, suggesting a tight blood- tissue barrier for this NP. Furthermore, dPG35S amine was found in the faeces and at early time points in the urine. Taken together these data do indeed suggest a partial elimination via the liver and kidney, but apart from that dPG35S amine is retained in the Mononuclear Phagocyte System (MPS). Particles that are not readily degraded in macrophages become sequestered, as confirmed by LMA for dPG35S amine. The long apparent terminal blood half-life of dPG35S amine, exceeding 12 days, also indicates retention. Apart from the delayed onset, the distribution of this NP to the organs after s.c. application was very similar to its i.v. application. In this study neither the clinical evaluation during the experiment nor the gross and histopathological analysis of the examined tissue showed any adverse effects. Thus, from a pathomorphological point of view, there was no evidence that would impede future investigations of dPGS for biomedical usage. Accumulation of dPGS in MPS cells, which is known for other charged NPs as well and depends on the protein corona of the NP, however, always bears the risk of toxicity and hinders an application as a therapeutic or diagnostic agent. In addition, retained NPs may interfere with diagnostic imaging. The retention of dPGS in MPS cells will have to be addressed using long-term and repeated-dose toxicity testing as well as in any further attempts to develop dPGS for biomedical applications.Die Vorsilbe „Nano“ bezeichnet alle Materialen kleiner als 100 nm in einer Dimension. Materialien mit allen Abmessungen im nanoskalaren Bereich werden als Nanopartikel (NPs) bezeichnet. In dieser Größenordnung treten Quanteneffekte zum Vorschein. Zudem zeigen Nanomaterialien (NMs) als Folge ihres hohen Fläche-zu-Masse-Verhältnisses eine erhöhte Reaktivität. Aus den besonderen Eigenschaften von NMs ergeben sich viele Chancen für Innovationen in Industrie und Biomedizin. In der Biomedizin umfasst ihr Einsatzbereich Medizinprodukte, in vitro und in vivo Diagnostik, Arzneimittelträger und Therapeutika. Ein vielversprechender NP für verschiedenste biomedizinische Anwendungen, von denen die größte Bedeutung in der Diagnose und Therapie von Entzündungen liegt, ist das dendritische Polyglycerol Sulfat (dPGS). Die besonderen Eigenschaften von NMs können jedoch auch zu unvorhersehbarem Verhalten führen und ein Sicherheitsrisiko beinhalten. Probleme beim Risikomanagement von NMs sind insbesondere der fehlende Konsens und die fehlende Verfügbarkeit von geeigneten Prüfmethoden. Außerdem sind bis heute nur für wenige NMs spezifische regulatorische Leitlinien erlassen worden. Für die präklinische Zulassung wird der überwiegende Anteil der NMs genau wie „reguläre“ niedermolekulare Arzneimittel reguliert. Dies erfolgt gemäß der Leitlinie M3(R2) des Internationalen Rates für Harmonisierung technischer Anforderungen an Pharmazeutika für den menschlichen Gebrauch. Entsprechend M3(R2) beinhaltet die präklinische Arzneimittelzulassung: Pharmakologie, Toxi- und Pharmakokinetik sowie Untersuchungen zur Toxizität. Für eine Risikoeinschätzung könnten jedoch weitere Parameter benötigt werden, welche die besonderen Eigenschaften wie beispielsweise die Partikelgröße oder Aggregationseffekte von NMs berücksichtigen. Darüber hinaus können Standardtests mit NMs interferieren und müssen verifiziert werden. Die vorliegende Studie untersucht die Kinetik sowie die akute und subakute Toxikopathologie von dPGS und trägt somit zu einer Grundlage für weitere Forschung in Richtung Arzneimittelzulassung bei. In vorangegangenen Wirksamkeitsstudien gegen Entzündungen zeigten fluoreszenzmarkierte dPGS in vivo keine offensichtlichen akuten Nebenwirkungen. Soweit war die Beurteilung der biomedizinischen Anwendbarkeit von dPGS sehr vielversprechend, jedoch lagen keine systematisch erhobenen Daten gesunder Tiere vor, welche die Verteilung, Ausscheidung und Histopathologie als übliche Bestimmungsgrößen einer präklinischen Sicherheitsbewertung berücksichtigen. Außerdem wird angenommen, dass eine Fluoreszenzmarkierung die Eigenschaften eines NP verändert, so zu einer abweichenden Bioverteilung führt und folglich eine Verifikation erfordert. Darüber hinaus erlaubt die Fluoreszenzmarkierung keine histopathologische Beurteilung. Geeignete Techniken, um „weiche“ NPs wie dPGS in vivo nachzuweisen, sind allerdings nur begrenzt vorhanden. Aufgrund ihrer geringen Größe entziehen sich alle NPs der Wellenlänge des Lichts und benötigen eine Markierung, um unter dem Lichtmikroskop sichtbar zu sein. Die niedrige Atomzahl „weicher“ NPs schließt jedoch auch den Einsatz der Elektronenmikroskopie aus. Es gibt innovative Methoden, wie beispielsweise die Raman-Spektroskopie, die keine Markierung benötigen, mit denen man NPs in Zellen lokalisieren sowie zelluläre Veränderungen beurteilen kann. Diese haben jedoch den Nachteil, technisch anspruchsvoll und nicht allgemein verfügbar zu sein. Eine Alternative zur Markierung mit Fluorophoren ist die Markierung mit Radioisotopen. Sofern das Isotop gut integriert ist, bleibt die chemische Struktur des NP dabei erhalten. Die Strahlung kann mit der Ganzkörper- / Ganzorganautoradiographie (WBA/WOA) aufgezeichnet werden oder dazu verwendet werden, um quantitative kinetische Studien mit der quantitativen Ganzkörper- / Ganzorganautoradiographie (QWBA/QWOA) sowie mit der Flüssigszintillationszählung (LSC) durchzuführen. Diese Techniken stellen jedoch nur Daten auf Gewebeebene bereit. Um radioaktiv markierte NPs in Zellen nachzuweisen, wurde in diesere Studie die lichtmikroskopische Autoradiographie (LMA) etabliert. Die LMA lässt auch eine simultane histopathologische Untersuchung zu. Das Radioisotop 35S wurde eigens für diese Studie in den dPGS NP integriert. Weil Schwefel ein Bestandteil von dPGS ist, war dieses Isotop besonders geeignet. Zu beachten ist, dass funktionelle Aminogruppen für eine einfache Konjugation mit Farbstoffen oder Arzneimitteln eingefügt wurden. Das daraus resultierende radioaktive dPG35S amine wurde gesunden Mäusen i.v. oder s.c. verabreicht. Die Mäuse wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Applikation getötet, aber nicht entblutet und Proben für die LSC und die Autoradiographie (WOA, QWOA und LMA) wurden entnommen. Die dPG35S amine Konzentration in Leber und Milz stieg bis zum Tag 5 bzw. Tag 21 nach der i.v. Applikation an. Bei der Untersuchung von Gewebeschnitten mit der LMA wurde dPG35S amine in den Kupffer Zellen der Leber sowie in der roten Milzpulpa 24 Stunden, 5 und 21 Tage nach seiner Verabreichung lokalisiert. In anderen Organen wie Niere, Lunge, Darm, Hoden und Gehirn nahm die dPG35S amine Konzentration gesamt gesehen über die Zeit ab. Dabei wurden nur geringe Konzentrationen in den Hoden und nur marginale Konzentrationen im Gehirn gemessen, was auf eine dichte Blut-Gewebe-Schranke für diesen NP hindeutet. Des Weiteren wurde dPG35S amine im Kot und zu den frühen Zeitpunkten auch im Urin nachgewiesen. Diese Daten legen zusammengenommen zwar eine partielle Ausscheidung über Leber und Niere nahe, aber davon abgesehen wird dPG35S amine im Mononukleären Phagozytensystem (MPS) zurückbehalten. Partikel, die in Makrophagen nicht rasch degradiert werden, werden sequestriert, wie es für dPG35S amine durch die LMA bestätigt wurde. Auch die lange, vermutlich terminale Halbwertszeit von dPG35S amine von über 12 Tagen weist auf eine Retention hin. Abgesehen von einem verzögerten Einsetzen der Verteilung dieses NP in die Organe nach s.c. Applikation, war diese der Verteilung nach i.v. Applikation sehr ähnlich. In der vorliegenden Studie zeigten sich weder in klinischen Untersuchungen während des Experiments noch durch makro- oder histopathologische Beurteilung des untersuchten Gewebes Nebenwirkungen. Vom pathomorphologischen Standpunkt aus gibt es daher keine Hinweise, die gegen eine weitere Erforschung von dPGS für biomedizinische Zwecke sprechen. Die Anreicherung von dPGS in MPS Zellen, welche auch für andere geladene NPs bekannt ist und von der Proteinkorona des NP abhängt, beinhaltet hingegen immer das Risiko einer Toxizität, wodurch eine Anwendung als Therapeutikum oder Diagnostikum schwierig wird. Außerdem können zurückgehaltene NPs mit diagnostischer Bildgebung interferieren. Die Retention von dPGS in MPS Zellen wird daher in Toxizitätsuntersuchungen durch Langzeit- und Mehrfachapplikationen sowie in allen zukünftigen Bestrebungen, dPGS für die biomedizinische Anwendung zu entwickeln, berücksichtigt werden müssen