Methylation analysis of HLA-A, ULBP2 and ULBP3 in colorectal cancer cells

Zentrale Fragestellung der Arbeit war es, eine mögliche funktionelle Verknüpfung zwischen dem Onkoprotein Ras und dem Prozess der DNA-Methylierung in der Suppression bestimmter für die Tumorabwehr wichtiger Gene experimentell zu unterstützen. Eine Verminderung der MHC-I-Expression wurde bereits im Zusammenhang mit Ras beschrieben. Weitere wichtige Erkennungs-Moleküle für NK- Zellen und T-Zellen sind ULBPs, MHC-Klasse-I verwandte Liganden der Natürlichen Killerzellrezeptoren (NKG2D). Die ULBP-Expression ist bis jetzt nur wenig verstanden. Gesundes Gewebe exprimiert kaum ULBPs, wohingegen krankes Gewebe als Stressantwort normalerweise eine deutliche Oberflächenanreicherung verschiedenster NKG2D-Liganden (MIC-A, MIC-B, ULBP1/2/3) zeigt. Im Hinblick auf Tumoren findet sich ein heterogenes Bild. Einige Tumore exprimieren wie vermeintlich gesundes Gewebe gar keine Liganden, andere sehr viele. Aufgrund der vielseitigen therapeutischen Ansatzmöglichkeiten, die sich aus der Aufklärung der Regulationsmechanismen der NKG2D-Liganden ergeben könnten, sind diese ubiquitärer Gegenstand der aktuellen tumorimmunologischen Forschung. Um einen potentiellen Zusammenhang zwischen Ras, DNA-Methylierung und Gensuppression zu untersuchen, wurden Genexpressionsprofile für die humane Kolonkarzinom Zelllinie HCT116 erstellt. Unter den supprimierten Genen, die nach Inhibition der Ras-Raf-Mek-Erk-Kaskade wieder aufreguliert wurden, befanden sich HLA-A1/2 und ULBP2 und -3. In der vorliegenden Arbeit analysierten wir die Methylierungsmuster der Promotoren dieser Gene mittels Bisulfitsequenzierung in der parentalen HCT116 Zelllinie und in drei weiteren von Rhee et al. generierten Knockout-Zelllinien: HCT116 DNMT1-/-, DNMT3b-/- und DKO. Der ULBP2-Promotor zeigte eine signifikante Hypermethylierung, die nach einer Behandlung mit dem Mek/Erk-Inhibitor U0126 nahezu vollständig aufgehoben werden konnte. Weiterhin konnten wir eine deutliche Hypomethylierung in den drei Knockout-Zelllinien DNMT1-/-, DNMT3b-/- und DKO zeigen. HLA-A1/2 waren nicht methyliert, jedoch ergaben Vorexperimente nach Mek/Erk-Inhibierung und Doppelknockout eine vermehrte Oberflächenexpression für beide Allele. Sowohl ULBP2, als auch HLA-A1/2 scheinen durch ein abgestimmtes Zusammenspiel zwischen onkogenem Ras und DNMTs direkt bzw. indirekt reguliert zu werden. Unsere Ergebnisse verknüpfen daher die DNMT-Aktivität mit dem K-Ras induzierten Mek/Erk-Signalweg auf der Ebene der Zielgene. Die Ras-vermittelte und DNMT-abhängige Suppression der Immunerkennung könnte zukünftig in der Behandlung von Tumoren mit Inhibitoren der Mek/Erk-Signalkaskade einen wichtigen Fortschritt in der Immuntherapie bedeuten.Most malignant features of cancer cells are triggered by activated oncogenes and the loss of tumor suppressors due to mutation or epigenetic inactivation. It is still unclear, to what extend the escape of emerging cancer cells from recognition and elimination by the immune system is determined by similar mechanisms. Previously transcriptomes of HCT116 colorectal cancer cells deficient in DNA methyltransferases (DNMTs) and of cells, in which the RAS pathway as the major growth-promoting signaling system is blocked by inhibition of MAPK were compared. Interestingly the MHC Class I genes HLA-A1/A2 and the ULBP2 gene encoding 1 of the 8 known ligands of the activating NK receptor NKG2D were among a cluster of immune genes up-regulated under the conditions of both DNMT-deficiency and MEK-inhibition. Bisulphite sequencing analyses of HCT116 with DNMT deficiency or after MEK-inhibition showed that de-methylation of the ULPB2 promoter correlated with its enhanced surface expression. Cosuppression of HLA Class I and NKG2D ligands and genes encoding peptide transporters or proteasomal genes mediates a strong functional link between RAS activation, DNMT activity and disruption of the antigen presenting system controlling immune recognition in colorectal cancer cells