Regulation of the major isoform of human endothelin-converting enzyme-1 by a strong housekeeping promoter modulated by polymorphic microsatellites

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Material und Methoden Ergebnisse Diskussion LiteraturverzeichnisHumanes endothelin-converting-enzyme (ECE)-1, das Hauptenzym in der Endothelinbiosynthese, zeigt eine breite Zell- und Gewebeexpression innerhalb des Kardiovaskulären Systems. Die Expression von ECE-1c, das die Hauptisoform repräsentiert, wird gelenkt durch einen alternativen Promotor. Die Mechanismen der ECE-1c Promotorregulation waren jedoch bisher weitestgehend unbekannt. Da die ECE-1c Transkription von mehreren Startpunkten aus beginnt, konnte man eine ECE-1c Promotorfunktion als houskeeping Promotor annehmen. Mittels promotor reporter assays , gel-shifts und supershift assays konnte die Funktionalität von cis-wirkenden Elementen für die Bindung der CAAT-Box bindenden Proteine NF-YB, GATA-2, E2F und eines GC-Box bindenden Faktors, die räumlich assoziiert sind mit den Transkriptionsstartpunkten des ECE-1c, in humanen endothelialen EA.hy926-Zellen demonstriert werden. In der mehr upstream gelegenen Promotorregion wurden drei hoch polymorphe Dinukleotidwiederholungen, 5´(CA)n, (CG)n und 3´(CA)n, identifiziert, die die Promtorfunktion in endothelialen EA.hy926-Zellen stark beeinflussen (2,7-fache Aktivierung, wenn man das am stärksten aktive mit dem am wenigsten aktiven Allel vergleicht) und in ähnlicher Weise in humanen neuronalen KELLY-Zellen. Die Ergebnisse bilden eine molekulare Erklärung für die grundlegende Expression von ECE-1c mRNA. Die Modulation durch genetische und epigenetische Mechanismen, die in dieser Studie gezeigt wurden, könnte für die interindividuelle Variation der grundlegenden Endothelinsystemaktivität beim Menschen angesehen werden und darüberhinaus die individuelle Prädisposition für kardiovaskuläre Erkrankungen beeinflussen.BACKGROUND: Human endothelin-converting enzyme (ECE)-1, the key enzyme in endothelin biosynthesis, shows broad cell and tissue expression within the cardiovascular system. Expression of ECE-1c, which represents the major ECE-1 isoform, is directed by an alternative promoter, but the mechanisms of ECE-1c promoter regulation are largely unknown. As ECE-1c transcription is initiated from several start sites, we hypothesized that the ECE-1c promoter functions as a housekeeping promoter. OBJECTIVE: To investigate the putative housekeeping function of the ECE-1c promoter in vascular endothelial cells, which represent a main site of its expression. RESULTS: Using promoter reporter assays, gel shift and supershift assays, we have demonstrated, in human endothelial EA.hy926 cells, functionality of cis-acting elements for binding of the CAAT-box binding protein NF-YB, GATA-2) E2F-2, and a GC-box binding factor, which are spatially associated with transcriptional start sites of ECE-1c. In the more upstream promoter region we have identified three highly polymorphic dinucleotide repeats, 5'-(CA)n, (CG)n and 3'-(CA)n, which strongly affected promoter function in endothelial EA.hy926 cells (2.7-fold activation comparing the most active to the least active allele) and, in a similar manner, in human neuronal KELLY cells. Finally, by in-vitro methylation, we were able to achieve strong suppression of the ECE-1c promoter activity in endothelial cells. CONCLUSION: Our results provide a molecular explanation for constitutive expression of ECE-1c mRNA. Modulation by genetic and epigenetic mechanisms as revealed in our study may account for interindividual variation of the constitutive endothelin system activity in humans and thus influence individual predisposition to cardiovascular disease