Characterization of the antioxidant enzymes rhodanese and superoxide dismutase 1 in chronic renal failure

Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden in Monozyten die antioxidativ wirkenden Proteine Rhodanese und Superoxiddismutase 1 (SOD1) in Monozyten von Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz untersucht. Die mRNA-Expression wurde mit quantitativer Real-Time PCR, die Proteinexpression wurde mit Immunoblotting und quantitativem In-Cell Western Assay bestimmt. Die Produktion reaktiver Sauerstoff-radikale wurden mittels Fluoreszenz- Spektrophotometrie untersucht. Die Expressionsstudie zur Rhodanese zeigte bei dialysepflichtigen Patienten eine signifikant geringere mRNA- und Proteinexpression im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Zudem wiesen dialysepflichtige Patienten eine deutlich höhere Produktion an reaktiven Sauerstoffspezies auf. Es konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Rhodanese-Proteinexpression mit erhöhter mitochondrialer Superoxid-produktion korreliert. Des weiteren konnte festgestellt werden, dass HD-Patienten mit geringer Rhodaneseexpression eine höhere Mortalitätsrate haben als Patienten mit hoher Expression an Rhodanese. Für die SOD1-Untersuchung wurden zunächst von Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und gesunden Kontrollpersonen zweidimensionale SDS-Gele analysiert. Diese zeigten unterschiedliche Proteinmuster bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und gesunden Kontrollpersonen. Mittels MS/MS-Massen-spektrometrie konnte SOD1 identifiziert werden. Durch Immunfärbung der SOD1 konnten Unterschiede in der Expression zwischen den Gruppen quantifiziert werden. Die Proteinexpression war in HD- Patienten im Vergleich zu Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und gesunden Kontrollpersonen signifikant verringert. Dagegen war die SOD1-Genexpression in HD-Patienten signifikant erhöht, verglichen mit Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und gesunden Kontrollpersonen. Des weiteren ergab die Immunfärbung der zweidimensionalen SDS-Gele für die SOD1 verschiedene Spots, was auf Vorliegen unterschiedlicher SOD1 Proteinspezies schließen lässt. Im Rahmen einer weiteren Untersuchung konnte die Bedeutung der SOD1 innerhalb der antioxidativen Abwehr dargelegt werden. Setzt man Monozyten einer erhöhten Glucosekonzentration aus, steigt die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies signifikant an. Setzt man das SOD1-Mimetikum Tempol zu, wird diese Zunahme blockiert. Diese Untersuchung ergab Hinweise auf die Bedeutung der SOD1 bei Patienten mit Diabetes mellitus und diabetischer Nephropathie.Patients with chronic kidney disease (CKD), including dialysis patients (HD), have a high incidence of premature cardiovascular disease. It is the leading cause of mortality in these patients. In the present study the antioxidant emzymes rhodanese and superoxide dismutase 1 were analyzed in monocytes of patients with CKD. The mRNA expression was determined by quantitative real- time PCR, the protein expression was determined by Immunoblotting and in-cell Western assay. Reactive oxygen species were measured by fluorescence spectrometry. Monocytes of hemodialysis patients showed a significant decrease in rhodanese protein and mRNA expression compared to healthy subjects. At the same time they showed an increased whole cell reactive oxygen species production. Furthermore, the level of mitochondrial superoxide production was significantly correlated with rhodanese protein expression in monocytes. Survival of hemodialysis patients was significantly shorter when patients monocytes expressed a low rhodanese mRNA. The analysis of proteomic profiles in monocytes of patients with CKD, including HD patients, and control subjects by two-dimensional electrophoresis (2-DE) indicated differences in spot pattern. The SOD1 protein, which was identified by MS/MS mass spectrometry and immunoblotting, was reduced in kidney disease. The characterization of SOD1 protein by in-cell Western assay showed a significant decrease of SOD1 protein in HD patients compared to CKD patients and healthy subjects. SOD1 gene expression was significantly higher in HD patients compared to CKD patients, or control subjects. Furthermore, the immunostaining of 2-DE gel blot membranes with SOD1 antibody revealed six immunoreactive spots, suggesting the appearance of different SOD1 protein species. A further study showed the importance of SOD1 within the antioxidant defence. The incubation of monocytes with high glucose concentration induced an increase of reactive oxygen species production. The effect of glucose was blocked by the SOD1 mimetic Tempol