Molecular effects of adipose derived adult stem cells in wound healing on D-galactose induced skin aging model

Amaç Ve Hipotez: Organizmaya yüksek dozda alınan galaktoz, galaktoz oksidaz enzimi ile aldehitlere ve hidrojen perokside(H2O2) dönüşür. Oluşan hidrojen peroksid çeşitli metabolik reaksiyonlarla hidroksil radikali (OH-)'ne dönüşerek oksidatif hasar ile DNA hasarına yol açar. Çalışmamızda intraperitoneal olarak D -Galaktoz uygulaması ile oksidatif hasara yol açarak deri üzerinde yaşlanma modeli oluşturulmuş ve ADAS hücre uygulaması ile yaşlanmanın olumsuz etkilerini azaltmak amaçlanmıştır. Ratların inguinal bölgesinden alınan yağ greftinden Adipoz kökenli erişkin kök hücre (ADAS) elde edildi. Kültüre edilip, çoğaltılan ADAS hücreleri rat dorsumunda oluşturulan insizyon hattına uygulandı. Bu çalışmamız ADAS hücrelerinin diferansiyasyon özelliği, büyüme faktörleri ve sitokinler salınımı arttırarak yaşlanma belirtileri ve yara iyileşmesi üzerine olumlu etki edeceği varsayımı üzerine kurulmuştur. Gereç Ve Yöntem: Çalışmada 51 adet 230-280 g ağırlığında Sprague Dawley suşu rat kullanıldı. Ratların 3 tanesi yağ grefti donorü kullanıldı ve sakrifiye edildi. 48 adet rat dört gruba ayrıldı. Grup I (n=12) : İntraperitoneal d-galaktoz 50 mg/kg/gün uygulaması ,sırt insizyon hattına ADAS hücre uygulaması Grup II (n=12) : İntraperitoneal d-galaktoz 50 mg/kg/gün uygulaması ,sırt insizyon hattına Serum fizyolojik uygulaması Grup III (n=12) : İntraperitoneal 50 mg/kg/gün serum fizyolojik uygulaması ,sırt insizyon hattına ADAS hücre uygulaması Grup IV (n=12) : İntraperitoneal 50 mg/kg/gün serum fizyolojik uygulaması ,sırt insizyon hattına serum fizyolojik uygulaması yapılarak sütüre edildi. 4. gruptan 4 adet rat intraoperatif olarak, 2. Gruptan 1 adet rat postoperatif 2. Günde kanibalizm nedeni ile kaybedildi. ADAS hücreleri plazmid yardımı ile 'Yeşil floresan protein' ( GFP) ile işaretlenerek grup I ve III'teki ratların sırt insizyon hattına enjekte edildi. Tüm rat gruplarının yarısı yara iyileşmesinin önemli olan prolifrasyon döneminin ortası olan 14. gününde ve diğer yarısı yara iyileşmesinde matürasyon evresinin başlangıcı olan 28. Günde sakrifiye edildi. Sırt derisindeki insizyon skarı hattı histomorfolojik, immnuhistokimyasal özellikleri değerlendirildi. Sırt derisinden western blot yöntemi ile TRP-1,TRP-2,Tirozinaz enzimleri analizi yapıldı. Oksidatif hasarın kantitatif belirteci olarak ratların 12 saatlik idrarlarında kütle spektrometrisi ile 8-OH-d-Guanin ölçümü yapıldı. Bulgular : Deride yaşlanma ile oluşan yetersiz kollajen üretimi, vaskülarizasyonda azalma, melanin pigment artışı ve epidermal incelme deri üzerinde oluşturulan yara iyileşmesinde gecikmeye sebep olmaktadır. Ratların sakrifikasyonu esnasında grup 3 te tüylenmede artış, vaskülarizasyonda artış olduğu görüldü. Deri insizyon hattında grup 3 te kapiller yoğunlaşma olduğu görüldü. Histolojik incelemelerde VEGF, TGF- β, tip 1 kollajenin grup 1 ve grup 3 te yoğun olduğu görüldü. Plazmid yardımı ile 'Yeşil floresan protein' ( GFP) ile işaretlenerek grup I ve III'teki ratların sırt insizyon hattında ADAS hücre varlığı gösterildi. Western blot analizlerinde yaşlanmaya immnun yanıtta öneli rol oynayan TRP-1, TRP-2, Tirozinaz düzeylerinin grup II' de arttığı görüldü. Ratların 12 saatlik idrar sonuçlarında kütle spektrometrisi ile grup III'de 8-OH-d-Guanin düzeylerinde artış olduğu görüldü. Sonuç: Elde edilen sonuçlar eşliğinde yaşlanma belirtileri oluşan deride adipoz kökenli kök hücre uygulaması ile oluşan kollajen üretiminde artış, kapiller yoğunlukta artış, vaskülarizyon artışı, melanin sentezinde azalma ile belirtilerinin azaltıldığı söylenebilir. ADAS hücre uygulamasının ile deri kalitesinde artış ve yara iyileşmesine olumlu etkileri olduğu görülmektedir. Aim And Hypothesis: The aim of this study is to perform a skin aging model with use of intraperitoneal D-Galactose and investigate effects of adipose derived adult stem cells on D-Galactose induced skin aging damage. Materials And Method: In the study, 51 Sprague Dawley rats weighing 230-280 g were used. Three fat graft donor rats were used and sacrificed. 48 rats were divided into four groups. Group I (n=12) : 50 mg / kg / day D-galactose intraperitoneally application, application of ADAS cells to dorsal incision. Group II (n=12) : 50 mg / kg / day D-galactose intraperitoneally application, application of %0,9 NaCl to dorsal incision. Group III (n=12) : 50 mg / kg / day %0,9 NaCl intraperitoneally application, application of ADAS cells to dorsal incision. Group IV (n=12) : 50 mg / kg / day %0,9 NaCl intraperitoneally application, application of %0,9 NaCl to dorsal incision. Four rats intraoperatively from the group IV, 1 rat at postoperative and 2 rats from group II were lost by cannibalism as a result. ADAS cells labeled with the help of plasmid "green fluorescent protein" (GFP) were injected into the dorsal incision of the rats in Group I and III. Half of the rats from all groups were sacrificed on 14th day and the other half on day 28th . In the dorsal skin incision line, immunohistochemical and histomorphological properties were evaluated. TRP-1, TRP-2, Tyrosinase enzymes from dorsal skin was analyzed by Western Blot method. 8-OH guanine were measured by mass spectrometry as a quantitative marker of oxidative damage in the urine of rats with 12-hour. Findings: Inadequate skin collagen production, a reduction in vascularization, increased melanin pigment and epidermal thinning occurs with aging on the skin that causes a delay in wound healing. Pubescence of the dorsal skin and vascularization increased in group 3 during the sacrification was observed. Histological examination of VEGF, TGF-β, type 1 collagen in group 1 and group 3 was found to be intense. Group I and III, the presence of ADAS cells in rat dorsal incision was shown by the help of plasmid "green fluorescent protein" (GFP). The presence of important immune responses that play a role in aging TRP-1, TRP-2 and Tyrosinase levels in group II was found to increased. 8-OH guanine was found to be increased by mass spectrometry in 12-hour urine in the rats of group III. Results: Depending on these findings, ADAS administration comprises collagen production, increasing in capillary density and vascularization, decreasing in melanin synthesis on D-Galactose induced skin aging model