Evaluation of apoptosis after sperm cryopreservatıon

İnsan sperm örneklerinin depolanması yani sperm bankası oluşturabilmek için uzun yıllardır çeşitli çalışmalar yapılmış ve çeşitli metotlar denenmiştir. Amaç spermin en az yapısal ve fizyolojik zararla döllenme kapasitesini sürdürebilmesi olmuştur ve kriyoprezervasyonla bu kısmen başarılmıştır. Ancak günümüzde ne yazık ki kriyoprezervasyon için standart bir yöntem mevcut değildir ve henüz aydınlatılamamış bir çok soru vardır. Bu amaçla bu çalışmada kriyoprotektan farkının dondurma çözme sonrasında spermde DNA fragmantasyonuna etkisini araştırdık. Bu amaçla toplam 50 olgu (sperm motilite bozukluğu olan asthenozoospermia, 40 olgu ile motilite bozukluğu olmayan normozoospermia 10 olgu) çalışma kapsamına alındı. Olgulardan elde edilen semen örnekleri makroskobik olarak koagülasyon, likefaksiyon, görünüm, hacim, viskozite ve pH açısından değerlendirildi. Mikroskobik olarakta motilite, sperm konsantrasyonu morfoloji yönünden dünya sağlık örgütü (WHO) kritelerine göre değerlendirildi. Bundan sonraki aşamada her bir olgudan alınan semen örnekleri iki gruba ayrıldı. Yıkama öncesi grup ve yıkama sonrasında iki farklı solüsyon (Medicult ve TEST yolk buffer) ile dondurulup çözülen grup. Her iki gruba da DNA fragmantasyonunu göstermek için TUNEL yöntemi uygulandı. Apopitoz bulguları ultrastrüktürel olarak da TEM ile değerlendirildi. Böylece yıkama öncesi ve yıkama sonrası dondurulan ve çözünen gruplar ile iki kriyoprotektan madde arasındaki fark ortaya konmaya çalışıldı. Beklenildiği gibi sperm sayısı, total motilitede yıkama sonrası artış, dondurup çözme sonrası da anlamlı bir düşüş gözlendi. Ancak iki farklı kriyoprotektan karşılaştırıldığında, istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı. Çözme sonrası iki kriyoprotektan gurubu arasında DNA fragmantasyon ortalaması açısından ise anlamlı farklılık vardır. Sonuç olarak, bulgularımız spermin dondurma öncesi yıkanıp yıkanmama tartışmasına açıklık getirerek dondurma öncesi mutlaka yıkanması gerektiği doğrultusundadır. Ultrastrüktürel olarak da desteklenen, DNA fragmantasyonunun değerlendirildiği TUNEL testi sonucunda yıkanmamış örnekler ile yıkanan ve dondurulup çözünen örnekler arasında anlamlı fark ortaya konmuştur. For long years, different studies were made and different methods were tried to store human sperm specimens that's to say to form a sperm bank. The aim was to ensure sperm's continuousness of fertilization capacity with few morphological and physiological damages and this was achieved by cryopreservation partially. However, there is no any standard method for cryopreservation yet and there are lots of questions exist. In our study, we investigated the effect of different cryoprotectants on DNA fragmentation of sperm after freezing and thawing. Totally fifty cases investigated in our study: forty samples of asthenozoospermia with sperm motility defects and ten samples of normozoospermia with no sperm motility defects. Semen samples were macroscopically evaluated for liquefaction, volume, viscosity, appearance and pH values and coagulation. Samples also were evaluated microscopically for motility, sperm concentration and morphology according to the World Health Organization (WHO) criterias. After this stage, the semen samples were separated into two groups. The first group consisted of pre-washed samples. Second group consisted of post-washed with the followed freezing and thawing with two different cryoprotectants (MEDICULT and TEST yolk buffer) samples. In both groups in order to show DNA fragmentation TUNEL assay was performed. Apoptosis was evaluated ultrastructurally by TEM. Results: the total motility of the sperm number was increased in the second group and meaningful decrease seen in the first group. There was no statistical difference between the two cryoprotectan solutions. There was a meaningful statistical difference in the average of DNA fragmentation between the two cryoprotectans group. Conclusions: sperm should be washed before freezing. The evaluation of DNA fragmentation in TUNEL assay which was also supported by ultrastructural findings revealed that there is a difference between the pre- washed and post-washed freezed and thawed samples