El papel de los receptores KIR y FcyRIIIa en la respuesta ADCC mediada por IgG1

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 01-03-2019El anticuerpo monoclonal anti-IgG1 cetuximab es una terapia que bloquea al receptor EGFR de las células tumorales, lo que le convierte en una terapia eficaz debido al bloqueo de la ruta molecular de las MAPK responsable de la proliferación y supervivencia celular. Además, este fármaco posee la capacidad de activar la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC) desencadenada por las células NK del propio paciente. Lo interesante de activar la ADCC, es que este mecanismo es independiente de las mutaciones activadoras tanto de KRAS y BRAF, como de cualquier otra activación de la ruta de las MAPK por debajo del EGFR. Uno de los factores que van a determinar una mayor interacción con la fracción constante del anticuerpo cetuximab es el tipo de polimorfismo presente en el receptor de la fracción constante de las inmunoglobulinas presentes en la membrana de las células efectoras, en concreto FcyRIIa y FcyRIIIa. Además, sabemos que existen otros receptores en las células NK conocidos como receptores KIR. No todos los receptores KIR son activadores de la función de las células NK ya que estas moléculas son polimórficas. Por esta razón, nos planteamos estudiar que polimorfismos tanto en los receptores FcγR como en los genes KIR serían buenos marcadores predictivos de una mayor respuesta al cetuximab a través de la activación de la ADCC. Para ello, diseñamos un ensayo clínico multicéntrico en el que reclutamos 70 muestras de pacientes con cáncer colorrectal metastásico con mutación de KRAS, expresión del EGFR y con el polimorfismo favorable FcγRIIa-131H/R que fueron tratados con cetuximab. Sobre estas muestras evaluamos la expresión de los polimorfismos en el gen de FcyRIIIa y en los genes KIR. Tras evaluar los polimorfismos de FcγRIIIa (V158F, V158V y F158F) en nuestra cohorte de pacientes, no encontramos asociación con la supervivencia de los pacientes tratados con cetuximab. Sin embargo, encontramos una alta tendencia hacia la significancia con respecto a la supervivencia global asociada al gen KIR2DS4 (P=0.071). Profundizando en las variantes del gen KIR2DS4, encontramos que la variante completa (KIR2DS4-full) presentaba un peor pronóstico comparada con la variante con el receptor no funcional (KIR2DS4-RNF) (P=0.030). Posteriormente, diseñamos un modelo in vitro para validar la asociación entre los polimorfismos favorables encontrados y la capacidad de activación de la ADCC de las células NK mediante el cetuximab. Para ello, co-cultivamos la línea celular derivada de cáncer colorrectal con mutación de KRAS, LS147T, junto a células NK aisladas de donantes sanos positivas para los polimorfismos favorables descritos previamente. Interesantemente, los genotipos favorables con FcγRIIa-131(H/H ó H/R) y la variante delecionada que resulta en un receptor no funcional, KIR2DS4del, presentaron una mayor tasa de activación de ADCC mediada por el anticuerpo cetuximab.The anti-IgG1 monoclonal antibody cetuximab is a therapy that blocks the EGFR receptor of tumor cells. This treatment is an effective anti-neoplasic therapy to block the MAPK molecular pathway involved in cell proliferation and survival. In addition, this drug is able to activate antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) triggered by NK cells. Interestingly, ADCC mechanism is independent of both KRAS and BRAF activating mutations, and other activating factors of the MAPK pathway downstream EGFR. One of the factors that could determine the interaction between cetuximab´s IgG1 constant fraction is the polymorphism expressed in the cell membrane of effector T-cells called gamma chain receptor of immunoglobulin constant fraction receptor of the immunoglobulins (FcγRIIa and FcγRIIIa). In fact, it is know that in NK cells there are other receptors known as KIR receptors. Not all KIR receptors are activators of NK cell function since these molecules are polymorphic. For this reason, we based our study on the polymorphisms expressed in FcγR and KIR and dissected whether they could be good predictive markers of cetuximab response through ADCC activation. For this, we designed a multicentre clinical trial and recruited 70 samples from patients with metastatic colorectal cancer with KRAS mutation, EGFR expression and the previously described FcγRIIa-131H/R polymorphism as favorable for cetuximab response. On these samples, we evaluated the expression of the polymorphisms in FcγRIIIa and in the KIR genes. After evaluating the polymorphisms of FcγRIIIa (V158F, V158V and F158F) in our patient cohort, we found no association with patient survival after cetuximab treatment. However, we found a high trend towards significance between overall survival and KIR2DS4 (P = 0.071). Further research on this gene revealed that full variant (KIR2DS4-full) showed a worse prognosis compared to the variant with the non-functional receptor (KIR2DS4-RNF) (P = 0.030). Subsequently, we designed an in vitro model to validate the association between the favorable polymorphisms previously found, and the activation of ADCC by cetuximab. Then, we cocultured a colorectal cancer derived cell line that carries KRAS mutation, LS147T, together with NK cells isolated from healthy donors tested to be positive for favorable polymorphisms. Interestingly, FcγRIIa-131 (H/H or H/R), and the deleted variant gene that translate a nonfunctional receptor, KIR2DS4del, showed a higher activation rate of ADCC mediated by cetuximab antibody