Estudio del mecanismo autoproteolítico nativo de AG43 para su aplicación en expresión de proteínas recombinantes de fácil purificación en Escherichia coli

Memoria para optar al título de Ingeniero Civil QuímicoMemoria para optar al título de Ingeniero Civil en BiotecnologíaEn búsqueda de un sistema de expresión recombinante que reduzca los requerimientos de purificación respecto a los de alternativas existentes, se optó por desarrollar la secreción inducible. Para esto fue necesario definir los componentes del sistema junto con la variable operacional de control, cuya modificación activa la liberación de las proteínas producidas desde la célula hospedera al sobrenadante del cultivo. Las proteínas autotransportadoras poseen un sistema de secreción eficiente y constan de dos dominios distintivos en su forma madura: el dominio pasajero (DP), unidad funcional que se expone al medio extracelular, y la unidad de translocación (UT), que se inserta en la membrana externa para permitir el paso del DP desde el periplasma. Dentro de esta familia, el antígeno 43 (Ag43) de Escherichia coli K12 representa un candidato ideal como base para el sistema de expresión. El enlace peptídico que une al DP y la UT es clivado autoproteolíticamente y posteriormente ambos dominios permanecen asociados por interacciones no covalentes, por lo que se pueden separar fácilmente. Si en el corte o la asociación participan aminoácidos con cadenas laterales ácidas o básicas, una modificación en el pH del medio podría alterar su interacción, cambiando la tasa de liberación del DP. Para identificar la zona dentro de la proteína que cataliza la proteólisis se diseñaron variantes de Ag43 nativa con distintos segmentos del DP y enhanced green fluorescent protein (EGFP) como módulo reportero. Se construyeron mediante Gibson Assembly en vectores pET22 y luego se indujo su expresión. Analizando proteínas quiméricas tanto de células enteras como lisadas se comprueba que el corte ocurre incluso cuando se elimina el sitio activo propuesto en literatura, correspondiente a un motivo aspartil-proteasa dentro del DP. Utilizando la fluorescencia de EGFP se monitoreó la localización del DP en función del tiempo paralelamente en medios con pH 7, 6 y 5, observándose una disminución en la liberación hacia el sobrenadante a medida que éste se acidifica. Se determinó que el segmento del DP necesario para la autoproteólisis son sus últimos 50 aminoácidos (extremo carboxilo), lo que refuta el supuesto de que el sitio identificado previamente es responsable del corte. Dado que el pH óptimo de cultivo para E. coli es de 7 y la liberación máxima en el sobrenadante se registró para el mismo pH, se descarta la acidificación del medio como método para inducir la secreción. Existe la posibilidad de mantener la secuencia nativa y estudiar el comportamiento del fenómeno frente a cambios en otras variables de operación o identificar con exactitud los aminoácidos clave para el corte y la asociación entre dominios con el fin de someterlos a Ingeniería de Proteínas